巨細胞病毒感染

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巨細胞包涵體感染是由巨細胞病毒（cytomegalovirus，CMV）引起的先天性或后天性感染，有兩種類型，多數成為唾液腺的不顯性感染或慢性感染而長期存留。另一種是全身性疾病，稱巨細胞包涵體病（cytomegalic inclusion disease），比較少見，主要侵犯小嬰兒，其特點是在很多器官組織內發現含核內和胞漿內包涵體的巨大細胞，并伴有全身癥狀，是宮內病毒感染導致胎兒畸形的重要原因之一。　

CMV感染在全世界分布，人是CMV的唯一宿主。不同國家及不同經濟狀況感染率不同。成人CMV感染和免疫功能有密切關系。　　

病原體

巨細胞病毒屬皰疹病毒群，具有典型的皰疹病毒樣結構，是一種大DNA病毒，直徑為80-110納米，病毒殼體為20面對稱體，含有162個殼粒。周圍有單層或雙層的類脂蛋白套膜。它有1個血清型，可分3個以上亞型。它只能在活細胞中生長，一般用人的纖維母細胞培養。它在體外生長緩慢，復制周期為36-48小時。被巨細胞病毒感染的細胞在光學顯微鏡下檢查可見到細胞和核變大，有包涵體形成。核內包涵體周圍與核膜間有一輪“暈”，因而稱為“貓頭鷹眼細胞”，這種細胞具有形態學診斷意義。　　

診斷

單靠臨床表現不能診斷CMV感染，從臨床標本中分離出病毒，同時抗體呈出4倍以上增加或持續抗體滴度升高，將有助于診斷。　　

一、病毒分離

最好用唾液、尿液、生殖道分泌物、乳汁和白細胞，接種到人的成纖維細胞內繁殖和分離，細胞病變效應（CPE）在1天或數周后出現，經固定和HE染色后可觀察到巨細胞，核內有內包涵體，核周暈圈及嗜酸性胞漿內包涵體，很象“貓頭鷹眼”（owl′s eye）亦可用單克隆或多克隆抗體的熒光染色等方法檢查。　　

二、血清抗體檢測

最常用的有補體結合試驗（CF）、間接免疫熒光試驗（IIF）、免疫酶試驗（EIA）、間接血凝試驗（IHA）和放射免疫試驗（RIA）等檢測CMV-IgG和IgM抗體。當單份血清標本已確定既往有CMV感染時，應當立即留血清標本，以及間隔2周、4周、8周再留血清標本，結合病毒分離可作原發感染診斷。　　

三、DNA探針

已廣泛應用于檢測CMV，其中以32P標記的探針敏感性最高，對某些標本來說，雜交方法可能比病毒分離更敏感。　　

四、聚合酶鏈式反應（PCR）

（一）標本的采集及處理

采集的標本包括患者的血液、尿，以及腺體組織等。由全血制備的血沉棕黃層（buffy coats）可保存于-80℃；尿液標本可保存于液氮中。凍存標本應避免反復凍融。

尿液標本經2500r/min離心10min，以除去細胞碎片，收集上清液。由于尿液中含有PCR抑制劑，因此需用聚乙二醇（PEG6000）進行預處理：50μl尿上清與50μl 20%PEG6000和25μl 2mol/L NaCl混合，置冰浴中6h；15000r/min離心30min收集沉淀。再于6400r/min離心3min；盡可能吸去上清，將沉淀懸浮于蒸餾水中。該懸液可直接用于PCR擴增；擴增時應于100℃加熱10min，迅速置冰浴中冷卻。

（二）模板DNA的制備

1．由血液標本制備模板DNA

方法A：向血清中加入NaCl使最終濃度為150mmol/L；取10μl 此血清于70℃處理45s后即可直接進行PCR擴增。

方法B：由血沉棕黃層（BCP）制備：① 用PBS洗滌BCP兩次，收取沉淀。② 加入500μl 6mol/L鹽酸胍，勻漿。③ 加入30μl 10mmol/L EDTA，10mmol/L NaCl，30μl20% Sarcosyl和5μl 蛋白酶K（10mg/ml），混合均勻，60℃反應1h。④ 加入1130μl 的乙醇，-20℃沉淀1～2h。⑤ 離心收集DNA沉淀。⑥ 用70%乙醇洗兩次，最后將沉淀懸浮于少量10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA中。置4℃備用。

2.由冰凍組織標本制備模板DNA：① 用恒冷切片機切取一塊～10μm冰凍組織塊，置于1.5ml塑料管中。② 加入10%用緩沖液配制的福馬林。③ 10min后離心1～2min輕輕傾去上清液，沉淀用乙醇洗2次。④ 于室溫干燥10～60min。⑤ 加入抽提緩沖液（100mmol/L Tris-HCl，4mmol/L EDTA、pH8.0,400μg/ml蛋白酶K），使剛好浸沒沉淀物（約50～100μl ）；將沉淀搗碎。福馬林固定的或石蠟包埋組織經脫蠟和干燥后也可按此處理。⑥ 37℃放置過液。⑦ 置沸水中7min滅活蛋白酶K。⑧ 離心收集上清，取1～10μl 即可進行PCR擴增。

3.由尿液標本制備模板DNA：①100μl 尿上清液與100μl 6mol/L異硫氰酸胍，7μl 2mol/L NaCl和20μl 玻璃粉懸液（DNA PREP，Asahi Glass Co，Tokyo）混合。② 室溫放置10min后，6400r/min離心2min，收集沉淀。③ 沉淀用50%乙醇，10mmo/L Tris-HCl、pH7.4, 50mmol/L NaCl洗一次，6400r/min離心1min。④ 同樣洗滌沉淀2次，收集沉淀。⑤ 加入50μl 蒸餾水，于55℃作用15min。⑥ 15000r/min離心2min，收集上清（含HCMV DNA），進行PCR擴增，將此懸液于100℃加熱10min，并迅速于冰浴中冷卻。

（三）引物及探針

引物及探針的設計是根據已發表的CMV的直接早期蛋白基因的啟動子區和開始的4個外顯子序列、晚期抗原gp64基因以及磷酸化蛋白pp71基因序列。常用的引物和探針列在表3中。

（四）PCR擴增步驟

1．10×反應緩沖液：100mmol/L Tris-HCl、pH8.4，500mmol/L KCl，25mmol/L MgCl2，2mg/ml明膠。

Taq DNA 聚合酶：5U/μl 。

10×dNTP：4種dNTP各2.0mmol/L。

引物：100pmol/L。

2．常規PCR擴增

10×反應混合物（50μl）反應緩沖液 5μl

10×dNTP 5μl

模板DNA 5μl

Taq DNA聚合酶 0.2μl (IU)

引物各0.5μl

蒸餾水 3.8μl

加1～2滴礦物油。

將反應混合物于94℃加熱5min；然后于95℃ 30s，55℃ 40s，72℃ 60s，擴增35～40循環。

3．套式（nested）PCR擴增：①反應混合物的組成同（2），僅引物為IE2a和IE4b（包括了整個外顯子3，共721b），各100pmol。于94℃ 60s，52℃150s，72℃ 480s，擴增20循環。② 取2μl 上述擴增產物，各加100pmol的引物IE3a和IE3b補加其他試劑。然后，于94℃ 60s，52℃150s，72℃180s，擴增20循環。　　

（五）產物鑒定

擴增產物的分析可采用固相（濾膜）雜交和液相雜交試驗。

1．固相雜交：

① 預雜交液為3×SSPE，5×Denhardt，0.5%SDS和25%甲酰胺.含有擴增產物的濾膜于42℃預雜交30～60min。② 加入標記探針（10cpm/μg，2ng/ml），雜交30～60min。③ 用0.2×SSPE,.01%SDS分別于室溫洗滌濾膜3次,5min/次;于60℃洗一次,10min/次;再于室溫洗一次以上,5min/次。④ 自顯影。

2．液相雜交及電泳分析：

① 取1/10體積的擴增產物與0.5～1.0pmol末端記的探針混合。② 加入最終濃度為150mmol/L NaCl，10mmol/L磷酸鈉及1mmol/L EDTA溶液，使總體積為20μl 。③ 95℃ 10min，然后于56℃ 60min。④ 離心10s加入樣品緩沖液，于8%聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳。⑤ 電泳畢，用溴化乙錠染色，然后對X線片曝光，自顯影。

HCMV DNA分子很大，其堿基序列尚未全部搞清。雖然它的DNA的限制性內切酶片段長度具多形性，但是對其基因組的離散性還不清楚。用單一引物對進行PCR擴增，可鑒定90%的HCMV野型分離株；而采用針對不同HCMV序列的兩套以上的引物對，則可檢測幾乎所有的病毒株。因此，可根據情況使用兩對或兩對以上的位于基因組不同區域的引物進行PCR檢測。

在HCMV模板DNA制備過程中，有時會產生一些小片段DNA，在PCR反應時常導致一定水平的本底產物，從而影響對結果的判定。在這種情況下可采用套式PCR法，其基本原理就是靶DNA的擴增分為兩步：首先利用一對引物，擴增包括靶DNA在內的長片段DNA；然后取少量的擴增產物，利用只針對靶DNA的引物再進行第二次擴增。通過控制每步中的擴增循環數，即可防止由小片段DNA引起的假陽性。這種方法也可避免產生假陰性結果。

PCR檢測HCMV標本具有很高的敏感性。從HCMV感染的組織培養上清可檢測到相當于幾十個病毒的DNA分子或1～5PFU病毒的DNA序列。用非放射性寡核苷酸探針進行Southern雜交分析擴增產物，可從尿液標本中檢測到1pgHCMV DNA序列的水平；利用該系統，在4×104個細胞中只有一個病毒基因組即可檢測出，較斑點印跡雜交提高2×103倍。

PCR技術對HCMV感染的檢測具有臨床應用價值，因為體液中病毒DNA先于病毒感染的臨床癥狀或血清學證據的出現，可作為HCMV感染的早期指標。由于HCMV可通過胎盤內感染、產道感染等途徑傳播，而且受感染的新生兒死亡率較高，因此利用PCR進行早期診斷及采取及時的治療措施，對優生優育也有重要意義。利用這種方法，還可鑒定器官或組織移植手術中供體是否為HCMV與許多嚴重病癥的關系。再者，PCR檢測指標穩定，還可進行半定量分析，因此可作為評價各種抗病毒藥物療效的手段。　　

治療措施

巨細胞病毒感染的治療，可應用各種抗病毒制劑如GCV、抗巨細胞病毒的免疫球蛋白制劑、干擾素及轉移因子等。但這些藥物并不能解決根本問題，往往停藥后病毒又潛伏地回升，鑒于此種病毒可能作為艾滋病的病因之一，各國學者均在致力于控制其感染的研究。最近，美國學者研制出兩種活疫苗，初試后頗見效。一種是由AD169菌株研制成的；另一種是從TOWn菌株制成的，經非腸道給藥后，已明顯表現出有抗巨細胞病毒的效能，CMV抗體升高，導致免疫功能增強。　　

病原學

CMV屬于皰疹病毒群，是人類皰疹病毒組中最大的一種病毒，其形最大由162個殼粒（capsomer），正20面體構成。有典型的皰疹病毒結構。CMV只能在人纖維母細胞培養中增殖，而不能在其他動物細胞中生長，增殖非常緩慢，初次分離需一個多月才能出現特殊的細胞；細胞變園，膨脹，細胞及核巨大化，核周圍出現一輪“暈”的大型嗜酸性包涵體。

CMV在20%乙醚中最多存活2小時。pH<5時，或置于56℃30分鐘，或紫外線照射5分鐘可被充分滅活。CMV的感染性對凍融或存于-20℃或-50℃均不穩定，10%的家用漂白粉可使其感染性明顯降低。　　

發病機理

CMV感染可引起機體的免疫功能降低，特別是細胞免疫功能下降。CMV感染對胸腺發育及脾細胞、單核吞噬細胞、NK細胞及CTL細胞的功能有著顯著的影響。　　

一、對胸腺、脾臟的影響

實驗室急性CMV感染的新生豚鼠，胸腺發育受抑，T細胞數減少，成年鼠感染CMV后，88%胸腺可檢出CMV。

CMV感染致脾功能受影響，脾臟淋巴細胞對conA刺激的增殖下降，脾細胞產生的IL-2顯著降低。　　

二、對免疫細胞的影響

CMV感染引起的免疫抑制與病毒在細胞內的復制有關。CMV可以在單核吞噬細胞、T細胞、B細胞及一些尚未確定的單核細胞中復制，其中單核吞噬細胞最易感染CMV，淋巴細胞在免疫反應中具有重要的調節功能和效應功能。CMV感染后，可引起淋巴細胞的多種免疫功能受損。

CMV感染多表現為急性單核細胞增多癥。外周血淋巴細胞對有絲分裂原、CMV抗原和HSV抗原增殖反應減弱，誘導干擾素水平下降，CD4/CD8比值從1.7±0.7下降為0.2+0.2,T細胞活性降低.這種變化有的可持續相當長時間,病后10個月，大多數患者T細胞亞群比例仍未完全恢復正常。

CMV感染的免疫抑制作用主要是被病毒感染的大單核細胞和CD8細胞的功能異常所致。單核吞噬細胞在抗CMV免疫中起著樞紐作用，不但可以直接吞噬、殺傷病毒，更重要的是可以處理、提呈抗原，分泌細胞因子，調控和擴大免疫反應。當CMV感染后，單核吞噬細胞功能受到影響，CMV感染巨噬細胞引起其吞噬功能降低，細胞內氧自由基產生減少，FC受體、補體受體的表達發生改變，且其抗原提呈功能降低，產生IL-1降低，對IL-1及IL-2的反應亦降低。Moses等用胸腺細胞增殖試驗檢測，IL-1活性降低，IL-1產生降低可引起TH/TS細胞比例失衡。

NK細胞有拮抗CMV擴散的作用。NK細胞積極參與了抗CMV感染的全過程，但存在高的NK活力不一定是保護性應答，而是活動性感染的證明。NK細胞雖不能阻止原發性CMV感染的出現，但一旦存在感染后，NK細胞能在CMV感染早期出現，有限制擴散、使感染局限的作用。NK細胞、CTL細胞是抗CMV的重要效應細胞。在CMV復制早期，感染性病毒體產生前，它們能裂解感染細胞，使病毒在細胞間擴散流產。在小鼠模型中，病毒作用了3-5天時，抗病毒效應由NK細胞介導，NK細胞活性可由IFN增強。6-21天，脾、外周血存在CTL細胞的殺傷活性。NK細胞、CTL細胞活性的高低決定了機體對CMV感染的敏感性及感染恢復的難易性。但CMV感染時，NK細胞及CTL細胞活性亦受到嚴重影響。此外，特異性細胞免疫有阻止CMV感染再發作用。有人檢測了20個發生CMV感染腎移植受者T細胞應答，發現有14個有CMV細胞毒應答，而6個不出現細胞毒應答者有嚴重的臨床后果。因此，特異性T細胞存在，有阻止CMV感染再發的作用。　　

三、抗體有降低CMV感染的毒力作用

機體受CMV的感染后，可出現多種抗體。乳汁、宮頸分泌物、唾液中盡管有特異性抗體出現，包括中和抗體。但仍能檢出CMV，說明抗體并不能阻止病毒擴散。胎兒從母體被動獲得的抗體不能阻斷經宮內、產道或乳汁傳播的感染。研究證明，致死性CMV攻擊前，在小鼠腹腔或靜脈注入0.2ml高效價抗CMV球蛋白，可完全保護動物免于死亡。1個月后再用CMV等二次攻擊，動物仍全部存活，表明抗體有降低CMV的毒力作用。

初次感染后，CMV將在宿主細胞中無限期存在成潛伏狀態。可能累及多種組織器官，尸檢提示肺、肝、胰、唾液腺、中樞神經系統及腸也可能是病毒潛伏場所。先天性感染的嚴重程度，與缺乏產生沉淀抗體的能力和T細胞對CMV的應答有關。兒童和成年人感染CMV后，在外周血中出現具有抑制細胞毒表型的活化T淋巴細胞，如果宿主的T細胞功能受損，潛伏的病毒就可能復活并引起多種癥候群。組織移植后發生的慢性刺激，為CMV活化，誘發疾病提供了條件。某些針對T細胞的強烈免疫抑制劑如抗胸腺細胞球蛋白，與臨床CMV癥候群高發率有關。此外，CMV在功能上可作為輔助因子，使潛伏感染的HIV活化。　　

流行病學

CMV感染在全世界分布，人是CMV的唯一宿主。不同國家及不同經濟狀況感染率不同。成人CMV感染和免疫功能有密切關系。如因器官移植而接受免疫抑制劑治療者，常因所供器官和輸入血液中有潛伏病毒，或免疫抑制使潛伏的病毒活化而發病，艾滋病患者的CMV感染發病率高。

傳染源是病人及其急性帶毒者，病毒可由乳汁、唾液及尿排出，可持續數周到幾年，人類易于感染，傳播途徑多種多樣。屬于性傳播性疾病。多從精液，宮頸分泌物，淚液及糞便（口腔性欲，吻肛）感染所致。

同源性CMV感染是輸血和器官移植的一種嚴重危害，多次輸血或一次大量輸血使原發和再發感染的危險性增高，輸入含白細胞血液的危險性更高，器官或骨髓移植術后CMV感染率也高。　　

臨床表現

CMV感染的自然史很復雜，在原發性感染以后排毒，往往持續數周、數月甚至數年，然后感染轉為潛伏。常有復發感染伴重新排毒。甚至在原發感染后很多年，潛伏病毒再激活，也可能有不同抗原性病毒株的再感染。CMV感染的臨床表現與個體免疫功能和年齡有關。不論從垂直感染、平行傳播或醫源性感染所出現的癥狀與體征都是多種多樣的。

關于后天性CMV感染癥，在臨床中常見于輸血后的單核細胞增多癥，由于免疫功能缺陷而發生血管、網膜炎、肺炎以及消化道感染。并且大多數患者合并格-巴氏綜合征。　　