醫(yī)院藥學(xué)/毒性實(shí)驗(yàn)法

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醫(yī)院藥學(xué)

醫(yī)院藥品檢驗(yàn)

（一）概述某一種新藥或一個的制劑，于臨床使用前，必須經(jīng)過這個步驟。雖然藥物對人的作用，不完全能在動物身上表現(xiàn)出來，但對一個藥物來說仍是一個很有用的參考數(shù)據(jù)。因此，為保證病人的用藥安全，新藥在臨床應(yīng)用前一定要進(jìn)行毒性試驗(yàn)。毒性試驗(yàn)的類型，可根據(jù)藥物的性質(zhì)及使用途徑、方法和時(shí)間等加以選擇。如有的藥物后則產(chǎn)生中毒癥狀；有的藥物需長期服用才能秦效等。因此，藥物的毒性試驗(yàn)，應(yīng)根據(jù)該藥物的特點(diǎn)來決定。

（二）急性毒性試驗(yàn)（一般安全試驗(yàn)）取體重18-22g的健康不白鼠5只，由尾靜脈（或腹腔）注射一定劑量的藥液（容量以0.5ml為宜，可用注射生理水稀釋成不同濃度），注射時(shí)間為4-5秒，觀察有無不良反應(yīng)（如驚厥、四肢癱瘓、步伐不穩(wěn)、豎毛、呼吸抑制等）或死亡。主要以死亡為指標(biāo)，注射后48小時(shí)內(nèi)不得有死亡。如有死亡應(yīng)加取小白鼠10只重新試驗(yàn)，全部小白鼠在48小時(shí)內(nèi)不得有死亡（做過本試驗(yàn)的小白鼠不得重復(fù)使用）。

【注】①供試品靜脈有困難時(shí)，可由腹腔注射，注射量仍為0.5ml，注射時(shí)間不限，注射后72小時(shí)內(nèi)不得有死亡。

②若某一藥物無安全試驗(yàn)劑量時(shí)，可將臨床人用劑量乘以一定的安全系數(shù)然后再折算成小白鼠體重的劑量。安全系數(shù)大小，應(yīng)根據(jù)該藥物的純度及臨床試驗(yàn)情況而定，一般治療性藥物可定為50－100，需長期服用的藥物可為100以上。

例：某注射液，成人（按體重50kg計(jì)），每次注射量為4ml，安全系數(shù)為50，則小白鼠（按20g計(jì)）的給藥劑量為：

小鼠劑量＝4×50／50000×20＝0.08ml

取該藥0.08ml加0.9％氯化注射液稀釋成0.5ml，作為供試品的注射用量。

③也可用同樣方法試驗(yàn)（即某一劑量注入小白鼠內(nèi)，若5只中只有1只死亡，則減劑量再試直至試出5只小白鼠均不死亡的最大劑量）。求出某藥物的安全系數(shù)。

計(jì)算公式：

安全系數(shù)＝小白鼠最大耐受量×成人體重（g）／成人用量×小白鼠體重（g）。

例：某藥特的劑量為4ml，當(dāng)劑量為0.2ml（稀釋至0.5ml），給小白鼠靜脈注埋時(shí)引起死亡，減劑量再試，在0.16ml/20g時(shí)，沒有反應(yīng)，故含有苯甲醇的注射劑，對試驗(yàn)往產(chǎn)生干擾，應(yīng)引起注意。

④苯甲醇對小白鼠有一定毒性反應(yīng)，故含有苯甲的注射劑，對試驗(yàn)結(jié)果往往產(chǎn)生干擾，應(yīng)引起注意。

（三）亞急性和慢性試驗(yàn) 需要較長期投用的藥物，應(yīng)做亞急性或慢性毒笥試驗(yàn)。方法和急性毒性試驗(yàn)基本相同，按小白鼠體重計(jì)算，每在在口服或腹腔注射劑量為人用劑量的20－50倍，連續(xù)用藥1－8周。慢性毒性，連續(xù)用3-6個月。在用藥期間，應(yīng)仔細(xì)觀察試驗(yàn)動物的體重、進(jìn)食量、進(jìn)水量的變化，以及有無不良反應(yīng)或死亡。動物在試驗(yàn)前后，均應(yīng)做血象、肝、腎等功能檢查，以資對照。試驗(yàn)中死亡或試驗(yàn)完畢的動物都要做解剖，觀察內(nèi)臟器管和組織切片檢查。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，判斷可否用于臨床。

【注】①亞急性，慢性毒性試驗(yàn)，均應(yīng)設(shè)對照。這是由于的飼養(yǎng)環(huán)境和健康情況的不同個體差異往往很大，給藥后內(nèi)臟的變化如無空白對照組做比較，常使實(shí)驗(yàn)結(jié)果難以判斷。

②非經(jīng)口服的藥品，應(yīng)注意須滅菌后作用，以免動物被染而影響結(jié)果。

③毒性實(shí)驗(yàn)的給藥途徑，應(yīng)盡量采用與臨床應(yīng)用的相同方法。給藥途徑不同毒性表現(xiàn)常是差別很大，如口服給藥的LD50比靜脈或腹腔注射的LD50大幾十倍。

④毒性實(shí)驗(yàn)前，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要考慮周密，應(yīng)盡力避免實(shí)驗(yàn)中臨時(shí)改變條件。實(shí)驗(yàn)用的動物，一般應(yīng)在本實(shí)驗(yàn)室條件下2周以上，使動物適應(yīng)環(huán)境后，再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

⑤實(shí)驗(yàn)室要注意加強(qiáng)對動物的管理，保持清潔衛(wèi)生。對實(shí)驗(yàn)中途死亡的動物應(yīng)做出客觀的分析，以便正確總結(jié)判斷。

⑥毒性實(shí)驗(yàn)中，除記錄計(jì)量指標(biāo)外，支動物的一般狀態(tài)如興奮、抑制、麻痹、呼吸、食欲、體重等應(yīng)進(jìn)行仔細(xì)地觀察、對實(shí)驗(yàn)中藥物出現(xiàn)作用的時(shí)間，速度以及毒副作用的特點(diǎn)等，均應(yīng)嚴(yán)密觀察，并詳細(xì)記錄，以便進(jìn)行綜合分析。

⑦在亞急性、慢性毒性實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)根據(jù)藥物的性質(zhì)和實(shí)驗(yàn)要求的不同，在給藥前后以及實(shí)驗(yàn)時(shí)，對實(shí)驗(yàn)動物易發(fā)生毒性反應(yīng)的主要器官進(jìn)行檢查。檢查項(xiàng)目有：

A血象：包括血色紅素、紅、白細(xì)胞及分類計(jì)數(shù)等。

B肝功能：肝臟是機(jī)體重要的代謝器官，不僅對糖、蛋白質(zhì)及脂類代謝起得要作用，也是許多藥物在體內(nèi)的解毒場所，故應(yīng)進(jìn)行肝臟功能的檢查。

C腎功能：大部分藥物從腎臟排泄，故應(yīng)測定藥物對腎功能有無損害及其損害的程度，其中包括血中非蛋白氮含量，小便常規(guī)檢查。

D組織切片：可進(jìn)一步了解藥物對各臟器有無損害及其損害的程度。可將動物在不同的期內(nèi)分批處死、取其心，肝、脾、肺腎、胃、腸等進(jìn)行切片檢查，并與對照比較，觀察藥物對各組織有無可逆或不可逆損害。

（四）半數(shù)致死量的測定半數(shù)致死量（簡稱LD50）是指藥物引起實(shí)驗(yàn)動物半數(shù)死亡的劑量。由于個體差異，同一劑量的藥物給同一動物，可以出現(xiàn)死亡或不死亡。而LD50在表示藥物毒性時(shí)，比較靈敏，準(zhǔn)確。一般以每kg多少mg表示（藥物劑量／體重）

測定LD50常用動物為小白鼠，體重18-22g，雄雌均可（雌的不得懷孕）將不同性別和體重的動物均勻分成4或6組，每組10只。給藥途徑和臨床應(yīng)用相同，給藥容量以0.5ml為宜。一般觀察3天，以死亡為主要指標(biāo)。

1．機(jī)率單位比例法精密稱取適量的檢品（如系溶液可精密量取），按等比級數(shù)（0.1、0.3、0.9……）或等差級數(shù)（0.1、0.2、0.3……）配成4種或6種濃度，分別用于4組或6組小白鼠，觀察在一定時(shí)間內(nèi)死亡情況，找出使小白鼠死亡數(shù)在50％以上和50％以下的兩個劑量（如各組小白鼠均無死亡或全死亡則表示劑量選擇不當(dāng)，須更換較高或料低劑理重試），按下列公式計(jì)算出半數(shù)致死量。

M＝高劑量的對數(shù)值

N＝低劑量的對數(shù)值

A＝高劑量所致小白鼠死亡百分率（大于50％）的機(jī)率單位

B＝低劑量所致小白鼠死亡百分率（小于50％）的機(jī)率單位

5＝50％死亡百分率的機(jī)率單位

例：烏頭堿注射液急性毒性試驗(yàn)結(jié)果。見下表。

烏頭堿注射液急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

劑量(mg/kg)	劑量對數(shù)值	死亡百分率	機(jī)率單位
29.50	1.4698	90	6.28
23.75	1.3756	40	4.7

LD50=24.60mg/kg

2．簡化機(jī)率單位法

（1）劑量預(yù)試：取小白鼠9只，均分3組，將被試藥物分大中小3個劑量，每個劑量各給1組動物觀察一定時(shí)間的死亡情況。如3組全死或全不死，應(yīng)重新選擇劑量再試，二至找到死亡率大于和小于50％的劑量。

（2）正式試驗(yàn)：取18-22g的健康小白鼠，雌雄兼有，按體重、性別均勻分組，每級10只。將預(yù)試中的找到的劑量范圍按等比級數(shù)分成2-4個劑量（須有使動物死亡率大于50％和小于50％的兩種劑量），劑量間的比例范圍內(nèi)為宜。每個劑量各給1組動物。給藥生觀察3天（有的可延長到7天），記錄動物的一般狀態(tài)和死亡數(shù)目。根據(jù)各劑量的組的死亡率，簡化機(jī)率單位求出LD50，其分工如下：

式中I為相鄰兩劑量比值（高劑量分子）的對數(shù)：y為各組死亡率相應(yīng)的機(jī)單位；y為各機(jī)率單位的平均數(shù)；X₁為小劑量的對數(shù)值。

【注】用本法則定藥物的LD50，在一般情況下采用兩組即可，將實(shí)驗(yàn)果代入分組時(shí)的公式中求出。分組、4組皆可，分組多，用動物多，計(jì)算復(fù)雜，但更準(zhǔn)確。

例：某新藥，要測定對小白鼠口服給藥的LD50，首先進(jìn)行劑理預(yù)試，將該藥物先分為700、800和1000mg/kg3種劑量，每劑量給3只小白鼠灌胃，觀察2天，結(jié)果700 mg/kg組死亡1只，800 mg/kg組殘廢只，1000 mg/kg組全部死亡。這樣，就找到了死亡率小于50％的劑量為700 mg/kg；大于50％的劑量為800和1000 mg/kg，依上述情況。估計(jì)用670和800 mg/kg可使動物死亡20％和60％左右，兩組劑量之比670／800為0.84。符合本法劑量比值范圍的要求。若分組時(shí)用此兩劑量可以實(shí)驗(yàn)；若用3組時(shí)，可按同樣的劑量比求出第三組劑量，即800／0.84＝952。這樣，670、800和952 mg/kg3個劑理組即成等比級數(shù)，其中每相鄰兩劑量比均為0.84。然后各劑量的組均給10只動物，觀察3天，記錄動物的一般狀態(tài)和死亡情況，結(jié)果如下表：

LD50實(shí)驗(yàn)觀察表

組別	劑量（mg/kg）	劑量對數(shù)（X）	鼠數(shù)	三天內(nèi)死亡數(shù)	死亡率（％）	機(jī)率單位(y)	機(jī)率單位平均值(y)	兩劑量比值的對數(shù)（i）
1	670	2.8261	10	2	20	4.16
2	800	2.9031	10	8	70	5.52	5.32	0.77
3	952	2.9786	10	9	90	6.28