凝集素
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凝集素（Lectin）是指一種從各種植物，無脊椎動物和高等動物中提純的糖蛋白或結(jié)合糖的蛋白，因其能凝集紅血球（含血型物質(zhì)），故名凝集素。常用的為植物凝集素（Phytoagglutin，PNA），通常以其被提取的植物命名，如刀豆素A（Conconvalina，ConA）、麥胚素（Wheat germ agglutinin，WGA）、花生凝集素（Peanut agglutinin，PNA）和大豆凝集素（Soybean agglutinin，SBA）等，凝集素是它們的總稱。
目錄 |
簡介
凝集素(lectin)
凝集素是動物細胞和植物細胞都能夠合成和分泌的、能與糖結(jié)
合的蛋白質(zhì),在細胞識別和粘著反應(yīng)中起重要作用,主要是促進細胞間的粘著。凝集素具有一個以上同糖結(jié)合的位點，因此能夠參與細胞的識別和粘著,將不同的細胞聯(lián)系起來。
凝集素（Lectin）是指一種從各種植物，無脊椎動物和高等動物中提純的糖蛋白或結(jié)合糖的蛋白，因其能凝集紅血球（含血型物質(zhì)），故名凝集素。其常見種類見表6-1。常用的為植物凝集素（Phytoagglutin, PNA），通常以其被提取的植物命名，如刀豆素A（Conconvalina,ConA）、麥胚素（Wheat germ agglutinin, WGA）、花生凝集素（Peanut agglutinin, PNA）和大豆凝集素（Soybean agglutinin, SBA）等，凝集素是它們的總稱。凝集素不是來源或參與免疫反應(yīng)的產(chǎn)物，它們之所以被收入本書，是由于凝集素具有的某些“親合”特性，能被免疫細胞化學(xué)技術(shù)方法所應(yīng)用。因此，Ponder（1983）提出應(yīng)稱“凝集素組織化學(xué)”而不能稱為“凝集素免疫組織化學(xué)”?！ ?/p>
凝集素的特性
凝集素具有多方面的特性，在此我們僅簡要提及其與免疫細胞化學(xué)技術(shù)方法應(yīng)用有關(guān)的某些特性。我們知道，生物膜中含有一定量的糖類，主要以糖蛋白和糖脂的形式存
在。凝集素最大的特點在于它們能識別糖蛋白和糖肽中，特別是細胞膜中復(fù)雜的碳水化合物結(jié)構(gòu)，即細胞膜表面的碳脂化合物決定簇。一種凝集素具有對某一種特異性糖基專一性結(jié)合的能力，如刀豆素與α-D-吡喃糖基甘露糖（α-D-Mannopyranosy）結(jié)合；麥芽素與N-乙酰糖胺（N-acetyl glucosamine）結(jié)合；菜豆凝集素與N-乙酰乳糖胺結(jié)合（見本章 表6-1）。 因此，凝集素可以作為一種探針來研究細胞膜上特定的糖基。另一方面，凝集素具有多價結(jié)合能力，能與熒光素、生物素、酶、膠體金和鐵蛋白等示蹤物結(jié)合，從而在光鏡與/或電鏡水平顯示其結(jié)合部位。
凝集素的應(yīng)用
一般認(rèn)為細胞膜上特定的糖基可用以區(qū)別細胞的類型和反映細胞在分化、成熟和腫瘤細胞性變中的變化。僅在某些特殊的例子，其細胞結(jié)合凝集素的性能可以預(yù)先估計，如雙花扁豆素之于血型A物質(zhì)的特異性，荊豆凝集素之于血型O物質(zhì)2-L-巖藻糖的特異性，然而在絕大多數(shù)情況下，關(guān)于由凝集素所識別的碳水化合物決定簇的種類，關(guān)于攜帶決定簇的分子的性質(zhì)和機能，完全憑實驗經(jīng)驗去發(fā)現(xiàn)?！ ?/p>
作為細胞分化的標(biāo)志
作為細胞分化和成熟的標(biāo)記 應(yīng)用凝集素作為細胞分化的標(biāo)志，在這方面的應(yīng)用報告最多，而且研究比較集中于血細胞，特別是淋巴細胞的分群。如Rose（1980）等發(fā)現(xiàn)在小鼠胸腺皮質(zhì)內(nèi)不成熟的T淋巴細胞呈PNA陽性反應(yīng)，在小鼠小腸集合淋巴小結(jié)的生發(fā)中心也發(fā)現(xiàn)有20%左右的PNA陽性反應(yīng)細胞，后者是否屬于不成熟的T淋巴細胞，是值得進一步研究的問題。Newman等（1979）以熒光素標(biāo)記凝集素PNA，發(fā)現(xiàn)在大鼠乳腺上皮的不同分化時期顯示不同的熒光強度。在不成熟的大鼠乳腺上皮細胞，熒光弱或無，隨著性成熟期到妊娠期乳腺上皮熒光程度逐漸加強，而泌乳期熒光強度達最高峰。在皮膚角質(zhì)細胞自基底向表層分化、成熟的過程中，細胞表面的碳水化合物的分布和性質(zhì)都在改變。Brabed等（1981）應(yīng)用新生大鼠皮膚的實驗表明，皮膚各層細胞分別與不同的凝集素相結(jié)合。麥芽素與角質(zhì)化細胞相結(jié)合，蓖麻素與棘細胞和基底細胞相結(jié)合，而荊豆凝集素標(biāo)記在棘細胞的表面。在成肌細胞（myeoblast）的分化與成熟過程中，Winaod 和Luzzati（1975）注意到類似的皮膚的改變?！ ?/p>
作為細胞特殊類型的標(biāo)記
Kivela和Farkkanen（1987）發(fā)現(xiàn)在人視網(wǎng)膜，PNA標(biāo)記視錐細胞而不標(biāo)記視桿細胞。在乳腺、乳腺上皮細胞呈PNA陽性反應(yīng)而肌上皮細胞和間質(zhì)細胞呈PNA陰性反應(yīng)。以多種凝集素對小鼠、大鼠和兔的腎組織切片進行染色結(jié)果表明，刀豆素A和蓖麻素存在于腎臟的各部，PNA和雙花扁豆凝集素（DBA）主要分布于遠曲小管和集合小管上皮細胞，荊豆凝集素（UEA）主要分布在血管內(nèi)皮細胞，而麥芽素分布在腎小球。應(yīng)用DBA對RIII和DDK品種的小鼠研究表明，DBA主要結(jié)合在各種組織內(nèi)毛細血
管內(nèi)皮細胞上，電鏡觀察顯示DBA結(jié)合在內(nèi)皮細胞的表面，在趣的是在RIII品系小鼠某些組織的內(nèi)皮細胞顯示肯定的DBA陰性反應(yīng)，說明同一種屬動物的血管內(nèi)皮細胞也存在有組織特異性的差別。Streit和Kreutzberg（1987）發(fā)現(xiàn)Griffonia Simplicifolia凝集素特異性標(biāo)記面神經(jīng)節(jié) 內(nèi)的小膠質(zhì)細胞，其它類型的膠質(zhì)細胞如星狀膠質(zhì)細胞（astrocyte）等都顯示陰性反應(yīng)。在切斷面神經(jīng)后，增殖的小膠質(zhì)細胞對Griffonia Simplicifolia凝集素的反應(yīng)加強，免疫電鏡觀察表明，凝集素主要沉積在細胞膜或小膠質(zhì)細胞突起的軸膜表面，特異性結(jié)合糖基是α-D-半乳糖。上海醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院免疫病理室應(yīng)用12種凝集素（表6-1）對人胚胎及各種正常組織進行了系統(tǒng)的凝集素受體的定位研究，結(jié)果表明，凝集素受體的分布并無即定規(guī)律可尋。如胃粘膜主細胞為PNA受體，而壁細胞為BSL受體，雙花扁豆受體（DBA）主要出現(xiàn)在大腸部份。
伴有細胞膜的改變
在腫瘤中凝集素結(jié)合的改變 腫瘤細胞伴有細胞膜的改變，細胞膜上的糖基也會產(chǎn)生相應(yīng)的變化，可用凝集素檢測出來。大量研究發(fā)現(xiàn)，凝集素可作為腫瘤組織源性的標(biāo)記、腫瘤特異性診斷的標(biāo)志、腫瘤惡性的標(biāo)記和不同腫瘤的分化標(biāo)記。如張華忠等（1987）報道115例胃癌標(biāo)記PHA陽性率高達90.43%，而正常胃粘膜基本是陰性，故認(rèn)為PHA是胃癌的診斷性標(biāo)志。BSA對乳腺惡性腫瘤陽性率達79%，而對良性病變均呈陰性反應(yīng)，提示BSA可能為乳腺惡性腫瘤的相關(guān)標(biāo)志。凝集素還有助于判別腫瘤的組織類型，如神經(jīng)系統(tǒng)星形細胞瘤ConA陽性，小膠質(zhì)細胞瘤陰性，腎腺癌UEA1陰性，透明細胞癌陽性?！ ?/p>
凝集素的分類
凝集素可按糖的特異性、分子結(jié)構(gòu)、結(jié)合位點和其功能進行分類。動物凝集素按分子結(jié)構(gòu)分為C-型凝集素、S-型凝集素、P-型凝集素、I-型凝集素和Pentraxins。C-型凝集素是Ca2+依賴的凝集素；S-型凝集素是特異性識別β-半乳糖苷鍵的凝集素；P-型凝集素是特異性識別6磷酸甘露糖的凝集素；I-型凝集素是類似免疫球蛋白的凝集素；Pentraxins是有五個亞基的凝集素?！ ?/p>
化學(xué)應(yīng)用
凝集素可為熒光素、酶和生物素等所標(biāo)記，分別進行下列染色法：
直接法
標(biāo)記物直接標(biāo)記在凝集素上，使之直接與切片中的相應(yīng)糖蛋白或糖脂相結(jié)合。
（1）切片脫蠟至水。
（2）凝集素標(biāo)記物（100μg/ml），室溫，30min。
（3）TBS洗3次，每次min。
（4）如為熒光素標(biāo)記物，封片用熒光顯微鏡觀察。如為酶標(biāo)記物，則應(yīng)依次進行呈色、脫水、透明和封固后在光學(xué)顯微下觀察。
直接法的優(yōu)點是簡便，目前商品用的凝集素藥盒已能購得。但靈敏性不夠高。
間接法
將凝集素直接與切片中的相應(yīng)糖基結(jié)合，而將標(biāo)記物結(jié)合在抗凝集素
抗體上。
（1）脫蠟至水。
（2）用含3%的H2O2的甲醇阻斷內(nèi)源性過氧化物酶10min。
（3）凝集素稀釋液（100μg/ml）孵育30min。
（4）TBS洗3次，每次min。
（5）用標(biāo)記了的抗凝集素抗體（1：100）孵育30min。
（6）TBS洗3次，每次min。
（7）呈色、脫水、透明、封片。
（8）觀察。
間接法染色還可進一步改良為：①三步法：即在凝集素孵育后，接著用抗凝集素抗體孵育，再用標(biāo)記了的抗-抗凝集素抗體孵育，層層放大，進一步提高其敏感性，PAP復(fù)合物也可作為標(biāo)記物標(biāo)記在抗-抗凝集素抗體上。②抗生物素—生物素凝集素法：用結(jié)合了生物素的凝集素孵育切片后，TBS洗后再以抗生物素—標(biāo)記物與之結(jié)合。間接法較直接法和直接法敏感性高5～10倍或更多一些，但必須購買或自制抗凝集素抗體?！ ?/p>
糖—凝集素—糖法
本法是利用過量的凝集素與組織切片中特定的糖基相結(jié)合。經(jīng)沖洗后，凝集素上還存在未被占用的結(jié)合部位，將這些部位與有過氧化物酶標(biāo)記的特異性糖基相結(jié)合，形成一個明治樣的糖—凝集素—糖的結(jié)合物。
（1）脫蠟至水。
（2）用含3%的H2O2的甲醇阻斷內(nèi)源性過氧化物酶10min。
（3）用100μg/ml的凝集素孵育30min。
（4）TBS洗3次，每次min。
（5）用100μg/mlHRP標(biāo)記的糖液孵育30min。
（6）TBS洗3次，每次min。
（7）DAB呈色、脫水、透明、封固。
本法特異性強，靈敏度高，因為這不象生物素—抗生物素法那樣要改變凝集素，又不需要像抗體那樣要制備抗體。HRP本身含有甘露糖，能與刀豆凝集素A、扁豆凝集素和豌豆凝集素結(jié)合。但對其它的凝集素，本法目前普及還有一定困難，因為要將過氧化物酶結(jié)合到其它凝集素上，就需要將一個適當(dāng)?shù)奶妓衔锘鶊F嵌入過氧化物酶，稱為糖基化（glycosylation），方法雖不復(fù)雜（Lee 等1976），但需一定的試劑和設(shè)備。商品化能提供的糖基化過氧化物酶品種尚有限?！ ?/p>
凝集素的性質(zhì)
至今在無脊椎動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的凝集素均是糖蛋白，糖以共價鍵形式結(jié)合進凝集素中，糖的種類主要包括有甘露糖、氨基葡萄糖、半乳糖，而少見木糖，阿拉伯糖。動物凝集素所含糖的種類和植物、微生物凝集素所含糖的種類不一樣，凝集素中蛋白質(zhì)部分主要由天冬氨酸、絲氨酸和蘇氨酸組成，少見含硫氨基酸。與部分凝集素活性相關(guān)的金屬離子常是Ca2+和Mg2+，這是許多糖進行結(jié)合或凝集活動所必需的。很多凝集素(如C一類型凝集素)發(fā)生凝集的一個必不可少的條件就是存在Ca2+ 。在賞凝集素(Limulin)中需要C擴+以類鈣調(diào)素形式進行生理活動;而在Anthocidariscr assispina中，則是Ca2+ 影響凝集素分子構(gòu)型:Ca2+影響牡蠣凝集素則是通過改變蛋白質(zhì)構(gòu)型，而不是直接參與配體結(jié)合。有人認(rèn)為Ca2+ 通過離子鍵與梭基等作用，以穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，增強氫鍵和疏水基團的相互作用。
凝集素進行的凝集反應(yīng)常被單糖所抑制，有的卻需某些二糖、三糖或多糖，被抑制的敏感性差別較大。某些典型特效凝集素易被相應(yīng)血型物質(zhì)中部分糖類所抑制，如A型血抗原特效的凝集素被N-乙酰-D一半乳糖所抑制;O型特效的凝集素被L一巖藻糖所抑制。凝集素結(jié)合糖類的專一性范圍不一。少數(shù)凝集素的結(jié)合范圍相當(dāng)窄。用蛋白酶，如胰蛋白酶、鏈霉蛋白酶等溫和處理凝集素，可使其凝集活動的敏感性得到提高，一些添加劑、金屬離子也影響凝集素活動?！ ?/p>
研究凝集素的意義
凝集素在動、植物體內(nèi)廣泛存在。凝集素最大的特點是能識別糖蛋白和糖脂中，特別是細胞膜中復(fù)雜的碳水化合物結(jié)構(gòu)，即細胞膜表面的糖基。一種凝集素具有只對某一種特異性糖基專一性結(jié)合的能力。因此，凝集素可以作為研究細胞膜結(jié)構(gòu)的探針。凝集素在無脊椎動物血液中具有多種生物活性，可以選擇凝集各種細胞，對腫瘤細胞有特異性凝集作用等，是免疫防御的重要體液因子之一。另一方面，凝集素具有多價結(jié)合能力，能與熒光素、酶、生物素、鐵蛋白及膠體金等結(jié)合、而不影響其生物活性，可用于光鏡或電鏡水平的免疫細胞化學(xué)研究工作，在探索細胞分化、增生和惡變的生物學(xué)演變過程，顯示腫瘤相關(guān)抗原物質(zhì)，以及對腫瘤的診斷評價等方面均有一定的價值。此外，植物凝集素在植物體內(nèi)也具有相當(dāng)重要的作用，如在種子萌發(fā)過程中的作用；作為植物胚細胞的促有絲分裂因子；在作物害蟲防治方面表現(xiàn)出的保護功能等等。研究凝集素的特異性有助于以分子或原子層次 (Molecular or atomic level) 了解生命現(xiàn)象或病理變化。
注意事項
①凝集素需要重金屬離子維持其活躍的結(jié)合部位，如果金屬離子耗盡了，
就會影響凝集素的結(jié)合能力。因此，有作者主張用TBS作為緩沖液，內(nèi)加微量的金屬，配方是：Tris 60.57g，NaCl87g，H2O加至1000ml，其中含CaCl2、MgCl2各1.0mmol/L?；蛟谶M入凝集素孵育前，先用該液孵育，以增強凝集素結(jié)合力。 ②和其它抗體血清應(yīng)用一樣， 應(yīng)用每批新的凝集素實驗時，都先要用緩沖液稀釋成不同等級；如8，16，32，64，125，250，500，1000μg/ml，經(jīng)染色選擇最佳稀釋度。
③有作者認(rèn)為阻斷組織內(nèi)源性過氧化物酶所用的H2O2對碳水化合物有影響，可能改變凝集素的結(jié)合形式，因此，應(yīng)盡量少用或不用，我們及一些作者在實驗過程中發(fā)現(xiàn)影響不明顯。
④有作者認(rèn)為凡經(jīng)固定的組織切片，不論是石蠟包埋切片或冰凍切片，都有可能使組織中抗原隱蔽，為了暴露隱蔽了的碳水化合物基團，主張在凝集素孵育前用酶處理切片，常用胰蛋白酶液（配制見附表）進行適當(dāng)?shù)姆跤?/p>
⑤已知哺乳動物的質(zhì)膜含有占蛋白總量的1%～10%的碳水化合物，它們以低聚糖（oligosacchride）糖脂，并主要以糖蛋白的形式存在，糖蛋白線性的或分支的旁鏈可能含有兩個到多個單糖殘基，通常有兩種或更多的單糖，在單糖單位末端常常是一個帶負電荷的N-乙酰神經(jīng)氨酸的殘基，一個唾液酸（siallic acid）。有作者在凝集素實驗中常用神經(jīng)氨酸酶(neuramidinase)分解細胞表面的唾液酸或神經(jīng)氨酸，以暴露出隱蔽的能與聚集素結(jié)合的次終末的碳水化合物。配制方法是將神經(jīng)氨酸酶（Type V，Sigma Lot 63F-8172 63F-8172）用醋酸緩沖液（含2%牛血清白蛋白）BSA配成0.5μg/ml。
切片脫蠟后進行酶消化的過程中，將該組織切片置于上述配制液中，在濕盒內(nèi)，37℃孵育30min。用緩沖液洗后，進行凝集素染色。
⑥對照試驗，和其它組化染色一樣，凝集素染色也需要設(shè)對照試驗（最好在相鄰切片進行）。由于凝集素具有單糖特異性，如果外加相應(yīng)的糖，把凝集素的結(jié)合部位占有了，凝集素就不能再與組織中的糖基相結(jié)合了。一般采用的方法是將凝集素預(yù)先與相應(yīng)的糖（0.2mol/L）在室溫孵育30min，使之占有凝集素結(jié)合部位，再將此液代替凝集素進行孵育，結(jié)果應(yīng)為陰性。在某些情況下即使提高糖液的濃度也不能達到完全的抑制。這時，只有用與凝集素有高親合力的低聚糖（oligosachrides）代替或?qū)⑶衅A(yù)先用相應(yīng)的糖苷酶孵育去除特異性糖基（Watanalte等，1981）。
抗體制備
1．HRP標(biāo)記凝集素法 適用于小量的凝集素標(biāo)記（Ponder 1983）。 （1）HRP的活化
①將10mg HRP(SigmaType VI)溶解在1ml 0.3mol/L 的重碳酸鈉溶液中（1.25g/50ml）。
②加50μl含1%氟二硝基苯的無水乙醇溶液，室溫輕度攪拌1h。
③加1ml含0.06mol/L的過碘酸鈉的蒸餾水（0.62g/50ml），室溫下輕度攪拌30min。
④在室溫下加兩滴0.16mol/L乙二醇，輕攪1h。
⑤用Sephadex G-25裝成小柱，用0.3mol/L的重碳酸鈉溶液，使含HRP的混合液過柱。
（2）結(jié)合
①正常條件下，可用凝集素及過氧化物酶各半量，但其比例可根據(jù)需要調(diào)整，以10mg凝集素溶解在25ml的重碳酸鹽緩沖液里，加到“活化”的HRP中去 ，這樣得出的凝集素濃度大約是0.3mg/ml，可加進0.1mol/L相應(yīng)的特異的糖，以保護凝集素結(jié)合時的結(jié)合部位。糖在下步透析或?qū)游鰰r去掉。
②在室溫下輕攪拌，結(jié)合3h。
③加入1mg硼氫化鈉，室溫下作用1h以穩(wěn)定結(jié)合物活性。
④用1N HCl調(diào)整pH至6.4，留置室溫下過夜。
（3）純化
①用適當(dāng)?shù)?a href="/w/%E5%87%9D%E8%83%B6%E5%B1%82%E6%9E%90" title="凝膠層析">凝膠層析柱如SephadexG—200、Saphacryl—300層析法將游離的凝集素、游離的過氧化物酶和高分子量的成分從結(jié)合物分離出去，包括抑制性的糖也在此時分離出去。
②提純后的結(jié)合物在280nm和403nm波長處測量其吸光率。用1%BSA先通過0.22μm的微孔過濾器，以確定被結(jié)合的凝集素是否被吸附在濾器中，然后上述結(jié)合物經(jīng)過該微孔濾過器過濾到一個無菌瓶中。
③加入疊氮鈉，濃度1：1000，保存于4℃C備用。
2．抗凝集素抗體的制備 抗凝集素抗體的制備法與一般免疫血清制備大致相同。所不同的是：①凝集素具有較強的毒性，易使被免疫動物發(fā)病或甚至死亡。解決的方法是經(jīng)處理使凝集素變性，從而減低其毒性，但同時要保證其抗原性不受或少受破壞。②要設(shè)法阻斷凝集素的糖結(jié)合部位，以減少對這些部位的抗體的產(chǎn)生，解決的辦法是預(yù)先以相應(yīng)的糖阻斷這些結(jié)合部位。Leathem 和Atkin（1982）設(shè)計了一個辦法，他們首先應(yīng)用瓊脂糖（Sepharose）珠，珠上有一系列共價糖的附著，這些糖可阻斷凝集素結(jié)合部位，這種糖珠有商品供應(yīng)（Sigma LtD），每1ml糖珠能結(jié)合大約12mg凝集素。其次用加入福爾馬林和加熱的方法使凝集素變性，毒性減低而不影響抗原性。具體操作如下：
①1ml瓊脂糖—半乳糖珠與1mg花生凝集素相結(jié)合，室溫1h。
②加入10ml 10%福爾馬林，在水浴中加熱到60℃，1h。
③用鹽水離心洗珠，將珠分成以10μl為單位的若干小份，保存在-20℃。
④皮下多處注射兩只家兔背部，每次注射100μl，每隔三周注射一次。取血40～50ml，保存在-20℃?zhèn)溆谩?/p>
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