生物化學(xué)與分子生物學(xué)/DNA復(fù)制的延長階段以及參與的酶和蛋白質(zhì)分子
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DNA 的復(fù)制實(shí)際上就是以 DNA 為模板在 DNA聚合酶 作用下，將游離的四種脫氧 單核苷酸(dATP,dGTP,dCTP,dTTP, 簡寫為 dNTP) 聚合成 DNA 的過程。
這是一個(gè)非常復(fù)雜的 酶促反應(yīng)，需要許多種酶和 蛋白質(zhì) 參與，現(xiàn)分別敘述它們在 DNA 復(fù)制中作用。
(一)DNA 的聚合反應(yīng)和 DNA 聚合酶
圖 16－9 DNA 聚合酶的作用
1957 年，Arthur kornberg 首次在 大腸桿菌 中發(fā)現(xiàn) DNA 聚合酶Ⅰ，(DNa polymerase Ⅰ, 簡寫 DNA polⅠ) 后來又相繼發(fā)現(xiàn)了 DNA 聚合酶Ⅱ和 DNA 聚合酶Ⅲ。(DNa polymerase Ⅱ，Ⅲ，簡寫 DNA polⅡ,DNA polⅢ) 實(shí)驗(yàn)證明大腸桿菌中 DNA 復(fù)制的主要過程靠 DNa polⅢ起作用，而 DNA polⅠ和 DNA polⅡ在 DNA 錯(cuò)配的校正和修復(fù)中起作用。見表 16－1。
這種酶的共同性質(zhì)是：①需要 DNA 模板，因此這類酶又稱為依賴 DNA 的 DNA 聚合酶 (DNa dependent DNA polymerase, DDDP)。②需要 RNA 或 DNA 做為 引物(primer)，即 DNA 聚合酶不能從頭 催化DNA 的起始。③催化 dNTP 加到引物的 3′桹 H 末端，因而 DNA 合成的方向是 5′→3′。圖 16-9。④三種 DNA 聚合酶都屬于 多功能酶，它們在 DNA 復(fù)制和修復(fù)過程的不同階段發(fā)揮作用。由于 DNA 聚合酶Ⅰ是研究得最清楚而且代表了其他 DNA 聚合酶的基本特點(diǎn)，所以我們著重介紹 DNa polⅠ的作用并指出另外二種 DNA pol 的特殊性：
1.DNA 聚合酶Ⅰ：
DNA polⅠ是由一條 多肽 鏈組成，分子量 為 109KD。酶 分子 中含有一個(gè) Zn++，是聚合活性必須的。
大腸桿菌每個(gè) 細(xì)胞 中約有 400 個(gè)酶分子，每個(gè)酶分子每分鐘在 37℃下能催化 667 個(gè) 核苷酸 參入到 DNA 鏈中，用 枯草桿菌蛋白酶 可將此酶水介成兩個(gè)片段，大片段分子量為 76KD，通常稱為 klenow 片段，小片段為 34KD。大小片段具有不同的 酶活性。
(1)DNA 聚合酶的 5′→3′聚合活性：
這是 DNA 聚合酶最主要的活性，按模板 DNA 上的核苷酸順序，將互補(bǔ)的 dNTP 逐個(gè)加到引物 RNA3′桹 H 末端，并促進(jìn) 3′桹 H 與 dNTP 的 5′桺 O4 形成 磷酸二酯鍵，酶的 專一性 表現(xiàn)為新進(jìn)入的 dNTP 必須與模板 DNA堿基配對 時(shí)才有催化作用，5′→3′聚合活性存在于 klenow 片段上 (圖 16－9 和圖 16-10)。
圖 16-10 DNA 聚合酶催化的 DNA 鏈延長
(2)DNA 聚合酶的 3′→5′外切 核酸酶 活性：
這種酶活性的主要功能是從 3′→5′方向識別并切除 DNA 生長鏈末端與模板 DNA 不配對而游離的核苷酸，這種功能稱為校對功能，這是保證其聚合作用的正確性不可缺少的，因此對于 DNA 復(fù)制中極高的保真性是至關(guān)重要的。
(3)DNA 聚合酶的 5′→3′外切核酸酶活性：
這種酶活性是從 DNA 鏈的 5′端向 3′末端水解已配對的核苷酸，本質(zhì)是切斷磷酸二酯鍵，每次能切除 10 個(gè)核苷酸。因此，這種酶活性在 DNA 損傷的修復(fù)中可能起重要作用，對完成的 DNA 片段去除 5′端的 RNA 引物也是必須的。
DNA polⅠ的 5′→3′聚合活性和 5′→3′外切酶活性協(xié)同作用，可以使 DNA 一條鏈上的切口從 5′→3′方向移動，這種反應(yīng)叫做缺刻平移 (nick translation)，利用此反應(yīng)可在體外對 DNA 片段進(jìn)行 放射性 磷 (α-32PdNTP) 的標(biāo)記制成 探針(probe)，進(jìn)行 核酸 的 分子雜交 實(shí)驗(yàn)，是現(xiàn)代分子 生物學(xué) 的一項(xiàng)重要技術(shù) (圖 16－11)。
圖 16-11 缺刻平移標(biāo)記 DNA 探針
許多實(shí)驗(yàn)證實(shí) DNA polⅠ并不是 DNA 復(fù)制過程中的主要酶，它的作用主要與 DNA 損傷后的修復(fù)有關(guān)。
2.DNA 聚合酶Ⅱ(DNA polⅡ)
此酶分子量為 120KD，每個(gè)細(xì)胞約有 100 個(gè)酶分子，但活性只有 DNa polⅠ的 5%，它具有 5′→3′聚合活性和 3′→5′外切活性，而沒有 5′→3′外切活性，它的作用可能與 DNA 損傷修復(fù)有關(guān)。
3.DNA 聚合酶Ⅲ(DNA polⅢ)
圖 16－12 DNA 聚合酶Ⅲ催化先導(dǎo)鏈和隨從的合成
這是在 DNA 復(fù)制過程中起主要作用的聚合酶，它是由一個(gè) 亞基 組成的蛋白質(zhì)分子，其分子量＞600kDa 整個(gè)酶分子形成一個(gè)不對稱的 二聚體，每個(gè)大腸桿菌細(xì)胞中只有 10?0 個(gè)酶分子，但催化 dNTP 參入 DNA 鏈的速率卻是最快的，約為 9000 核苷酸 / 每分鐘 / 每個(gè)酶分子。這也證明 DNa polⅢ是 DNA 復(fù)制過程中主要發(fā)揮作用的酶。在大腸桿菌 染色體DNA 進(jìn)行復(fù)制時(shí)，DNA 聚合酶Ⅲ全酶 并不是單獨(dú)起作用的，而是與 引發(fā)體，介 鏈酶 等構(gòu)成一個(gè)復(fù)制體 (replisome)。由于復(fù)制體的存在，先導(dǎo)鏈和隨從鏈可以同時(shí)復(fù)制。DNa polⅢ是由多亞基組成的不對稱二聚體，它可能同時(shí)負(fù)責(zé)先導(dǎo)鏈和隨從鏈的復(fù)制，在φ×174 的復(fù)制中觀察到引發(fā)體總是伴隨著 DNA 嚕噗 (loop) 的存在。圖 16?2 可以看到，由于隨從鏈的模板 DNA 在 DNA 聚合酶Ⅲ全酶上繞轉(zhuǎn)了 180°而形成一個(gè)嚕噗，因此崗崎片段的合成方向能夠與先導(dǎo)鏈的合成方向以及復(fù)制體移動方向保持一致。
隨著 DNA polⅢ向前移動，先導(dǎo)鏈的合成逐漸延長的同時(shí)，崗崎片段也在不斷延長，這一嚕噗也在不斷擴(kuò)大。當(dāng)崗崎片段合成到前一個(gè)片段的 5′端時(shí)，這一大嚕噗就釋放出來，由于 復(fù)制叉 向前移動又可將另一部分隨從鏈的模板置換出來，由引發(fā)體合成新的引物，然后再形成一個(gè)小的嚕噗，進(jìn)行新的崗崎片段的合成。由此模型不難看出：隨從鏈的合成需要 周期性 的引發(fā)，因此其合成進(jìn)度總是與 前導(dǎo)鏈 相差一個(gè)崗崎片段的長度。崗崎片段完成后，其 5′端的 RNA 引物由 DNa polⅠ的 5′→3′外切酶活性切除，由此造成的空隙再由 DNA polⅠ的 5′→3′聚合活性催化 dNTP 得到填補(bǔ)。所以 DNA 的復(fù)制是在 DNa polⅢ和 DNApolⅠ互相配合下完成的。
下面列表說明三種大腸桿菌 DNA 聚合酶的特性
表 16－1 大腸桿菌 DNA 聚合酶特征
| DNA 聚合酶Ⅰ | DNA 聚合酶Ⅱ | DNA 聚合酶Ⅲ | |
| 分子量 | 109KD | 120KD | ＞600KD |
| 每個(gè)細(xì)胞中的分子數(shù) | 400 | 17-100 | 10-20 |
| 5′→3′聚合活性 | + | + | + |
| 37℃轉(zhuǎn)化率核苷酸數(shù)／酶分子. 分鐘 | 600 | 30 | 30,000 |
| 5′→3′外切活性 | + | - | - |
| 3′→5′外切活性 | + | + | + |
| 切刻平移活性 | + | - | - |
| 對 dNTP 親和力 | 低 | 低 | 高 |
| 功能 | 修復(fù) | 不詳 | 復(fù)制 |
| 去除引物 | |||
| 填補(bǔ)空缺 |
真核生物DNA 聚合酶
真核生物 DNA 聚合酶有α、β、γ、δ及ε。它們的基本特性相似于大腸桿菌 DNA 聚合酶，其主要活性是催化 dNTP 的 5′→3′聚合活性，基本特征見表 16－2。
表 16-2 真核生物 DNA 聚合酶
| α | β | γ | δ | ε | |
| 亞基數(shù) | 4 | 4 | 4 | 2 | 5 |
| 分子量（KD) | ＞250 | 36-38 | 160-300 | 170 | 256 |
| 細(xì)胞內(nèi)定位 | 核 | 核 | 線粒體 | 核 | 核 |
| 5′→3′聚合活性 | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ |
| 3′→5′外切活性 | － | － | － | － | － |
| 功能 | 復(fù)制、引發(fā) | 修復(fù) | 復(fù)制 | 復(fù)制 | 復(fù)制 |
真核細(xì)胞 在 DNA 復(fù)制中起主要作用的是 DNA polα，主要負(fù)責(zé)染色體 DNA 的復(fù)制。DNa polβ的模板特異性是具有缺口的 DNA 分子，被認(rèn)為它與 DNA 修復(fù) 有關(guān)。DNa polγ在線粒體 DNA 的復(fù)制中起作用。DNA polδ不但有 5′→3′聚合活性，而且還具有 3′→5′外切酶活性，據(jù)認(rèn)為真核生物 DNA 復(fù)制是在 DNa polα和 DNA polδ協(xié)同作用下進(jìn)行的，前導(dǎo)鏈的合成靠 DNA polδ催化，并且還需要一種 細(xì)胞周期 調(diào)節(jié)因子椩鮒誠赴絲乖?proliferatingcell nucleus antigen, PCNA) 參與。而隨從鏈的合成靠 DNA polα和 引發(fā)酶 配合作用完成。
(二) 與 超螺旋 松馳有關(guān)的酶：
DNA 復(fù)制從起始點(diǎn)開始向一個(gè)方向復(fù)制時(shí)，局部的 DNA 雙鏈必須打開，主要靠 解鏈酶 的作用，打開后的 單鏈 還需要單鏈 結(jié)合蛋白 與其結(jié)合，在復(fù)制叉向前移動時(shí)造成其前方 DNA 分子所產(chǎn)生的正超螺旋，必須由 拓?fù)洚悩?gòu)酶 來解決。下面分別介紹它們的作用。
拓?fù)洚悩?gòu)酶 (topoisomerase) 是一類改變 DNA 拓?fù)湫再|(zhì)的酶。在體外可催化 DNA 的各種拓?fù)洚悩?gòu)化反應(yīng)，而在生物體內(nèi)它們可能參與了 DNA 的復(fù)制與 轉(zhuǎn)錄。在 DNA 復(fù)制時(shí)，復(fù)制叉行進(jìn)的前方 DNA 分子部分產(chǎn)生有正超螺旋，拓?fù)涿缚伤神Y超螺旋，有利于復(fù)制叉的前進(jìn)及 DNA 的合成。DNA 復(fù)制完成后，拓?fù)涿赣挚蓪?DNA 分子引入超螺旋，使 DNA 纏繞、折疊，壓縮以形成 染色質(zhì)。DNA 拓?fù)洚悩?gòu)酶有Ⅰ型和Ⅱ型，它們廣泛存在于 原核生物 及真核生物中。表 16－3
表 16－3 大腸桿菌和真核 生物 中的拓?fù)洚悩?gòu)酶
| 類型 | 作用 | 對超螺旋的作用 |
| Ⅰ型拓?fù)洚悩?gòu)酶 | ||
| 大腸桿菌 | 切開一股 DNA 鏈 | 松馳負(fù)超螺旋 |
| 真核生物 | 切開一股 DNA 鏈 | 松馳正，負(fù)超螺旋 |
| Ⅱ型拓?fù)洚悩?gòu)酶 | ||
| 大腸桿菌 | 切開二股 DNA 鏈 | 構(gòu)馳正超螺旋； |
| 依賴 ATP | 引入負(fù)超螺旋， | |
| 解環(huán)連等 | ||
| 真核生物 | 切開二股 DNA 鏈 | 松馳正超旋， |
| 依賴 ATP | 但不能引入負(fù)超螺旋 |
拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ(TopoⅠ) 的主要作用是將環(huán)狀雙鏈 DNA 的一條鏈切開一個(gè)口，切口處鏈的末端繞螺旋軸按照松馳超螺旋的方向轉(zhuǎn)動，然后再將切口封起來。這就使 DNA 復(fù)制叉移動時(shí)所引起的前方 DNA 正超螺旋得到緩解，利于 DNA 復(fù)制叉繼續(xù)向前打開。拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ除上述作用外，對環(huán)狀 單鏈 DNA 還有打結(jié)或解結(jié)作用，對環(huán)狀雙鏈 DNA 的環(huán)連或解連以及使環(huán)狀單鏈 DNA 形成環(huán)狀雙鏈 DNA 都有作用 (圖 16－13)。
圖 16－13 拓?fù)涿涪窦阿虻淖饔锰攸c(diǎn)
(a) 大腸桿菌拓?fù)涿涪翊呋?4 種拓?fù)洚悩?gòu)化作用 (b) 拓?fù)涿涪虻淖饔?/p>
拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ(TopoⅡ) 是在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)的，曾被稱為 旋轉(zhuǎn)酶(gyrase)，它們作用特點(diǎn)是切開環(huán)狀雙鏈 DNA 的兩條鏈，分子中的部分經(jīng)切口穿過而旋轉(zhuǎn)，然后封閉切口，TopoⅡ還可使 DNA 分子從超螺旋狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)樗神Y狀態(tài)，此反應(yīng)不需要 ATP 參與。DNA 復(fù)制完成后，TopoⅡ在 ATP 參與下，DNA 分子從松馳狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)樨?fù)超螺旋。此外，TopoⅡ催化的拓?fù)洚悩?gòu)化反應(yīng)還有環(huán)連或解環(huán)連，以及打結(jié)或解結(jié)。
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