脈沖場凝膠電泳
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（PFGE，Pulsed Field Gel Electrophoresis）是一種分離大分子DNA的方法。在普通的凝膠電泳中，大的DNA分子（>10kb）移動速度接近，很難分離形成足以區分的條帶。在脈沖場凝膠電泳中，電場不斷在兩種方向（有一定夾角，而不是相反的兩個方向）變動。DNA分子帶有負電荷，會朝正極移動。相對較小的分子在電場轉換后可以較快轉變移動方向，而較大的分子在凝膠中轉向較為困難。因此小分子向前移動的速度比大分子快。脈沖場凝膠電泳可以用來分離大小從10kb到10Mb的DNA分子。
目錄 |
高分子量DNA瓊脂糖凝膠塊制備和加工
1．收集10ml全血，加入30ml細胞裂解液。置冰浴中至少20min直至紅細胞完全溶解。
2．2000r/min離心10min，移去紅色上清液，再次用細胞裂解液洗滌細胞，然后用PBS重懸細胞。
3．稀釋單細胞懸液并取一小份用Neubauer腔計數細胞。
4．用PBS重懸細胞，以達到40μl PBS中含1百萬個細胞比例（1百萬個倍體哺乳動物大約含有基因組DNA 10μg）
5．用PBS配制2％濃度低熔點瓊脂糖溶液并保持在50℃。
6．將等體積（各1ml）細胞懸液與瓊脂糖溶液于室溫下混勻，立即倒入凝膠塊模具中。
7．靜置20min讓瓊脂糖固化，用無菌塑料杯（通常用作劃菌）將凝膠塊自模具中取出并置入蛋白酶緩沖液中，加入2mg/ml的蛋白酶K。
8．將帶有凝膠塊的蛋白酶K緩沖液于50℃保持2～3天。每個盛有50ml蛋白酶緩沖液的Falcon管可容納多達100個凝膠塊。
9．蛋白酶K消化后，可將凝膠塊保留在此緩沖液或0.5mol/L EDTA溶液中保存于4℃。
10． 此外，繼續將凝膠塊用高壓消毒過的TE緩沖液沖洗數遍的步驟。
11． 將凝膠塊放入裝有TE及0.04mg/ml PMSF溶液的Falcon試管中，滅活殘留的蛋白酶K。
12． 室溫下用TE溶液漂洗凝膠塊數次，將凝膠塊放入另一干凈的試管，可直接用于酶切反應或用0.5mol/L
EDTA，（pH8.0）4℃保存凝膠塊。
13． 若用EDTA保存凝膠塊，取出后應用TE溶液室溫下漂洗30 min×2次。
大小標準物的制備
λ多聯體
1．以TE緩沖液懸浮λ多聯體（Boehringer MA寶靈曼公司產品），濃度為4μg/40μl。
2．用等體積TE配制的2％低熔點瓊脂糖（溫度保持在45℃）混勻。
3．移去混合液注入預冷的凝膠塊模具中。
4．室溫下用TE及100 mmol/L NaCl溶液溫育2天。
酵母染色體
1．從YPD（酵母提取物，蛋白胨和葡萄糖）培養基瓶皿中挑選單一克隆加入10ml
YPD預培養的肉湯中，30℃下劇烈震蕩生長24小時，然后加入200ml YPD肉湯，劇烈振蕩24～48h（產量大約100塊）。
2．4000×g轉速，離心10min，然后用50mmol/L EDTA/10 mmol/L Tris-HCl(pH7.5)溶液懸浮。
3．仍以4000×g轉速離心10min，再用SCE[1 mol/L 山梨醇，0.1mol/L枸椽酸鈉，pH5.8及10 mmol/L
EDTA (pH7.5)]溶液重懸。
4．取稀釋后的細胞懸液用Neubauer腔計數。
5．溶液短暫離心后，再用SCE重懸細胞，使40μl SCE溶液中含5×107個細胞（相當于80μl體積的模塊中含有5×107個細胞）。
6．溶液與0.1mg/ml酵母扣糖酶100T和100mmol/Lβ-巰基乙醇混勻，37℃保溫15～30min。
7．細胞懸液與等體積的SCE配制的2％低熔點瓊脂糖凝膠混勻，保持在50℃。
8．將混合物移注入預冷的凝膠塊模具中。
9．凝膠塊用含10 mmol/L二硫蘇糖醇的SCE溶液37℃下振蕩溫育1～2小時。
10． 將凝膠塊移入蛋白酶緩沖液中，加入2mg/ml蛋白酶K，50℃溫育48h。
11． 用50 mmol/L EDTA/10 mmol/L Tris-HCl(pH7.5)溶液洗滌凝膠塊3次，每次min。
12． 凝膠塊可用此混合液于4℃保存或不用漂洗直接裝載入凝膠中。
瓊脂糖凝膠塊中DNA的限制性內切酶消化
1．應使用消毒溶液及戴無菌手套以免DNA降解。
2．在Falcon試管中用1×TE溶液漂洗凝膠塊20min 3次，以去除EDTA。
3．混合：酶反應緩沖液（高、中或低鹽緩沖液），100
mmol/L亞精胺（只用于高鹽緩沖液狀態），10～20單位的內切酶。20單位的內切酶就足以過夜完全消化10μg DNA。
4．設立一個除內切酶成分外含有混合物各組分的陰性對照，以檢查是否有非特異性DNA降解。
5．將瓊脂糖凝膠塊加入反應混合溶液中：通常用消毒過的手術刀或套環將凝膠塊移入。
6．若兩種內切酶所需緩沖液條件一致，可以同時或先后用兩種不同的酶進行消化（先用低鹽緩沖液的酶消化，再調整鹽濃度）。倘若首次消化的酶要求50℃條件，在第二個酶消化時要換緩沖液。
7．若要進行部分消化，則首先在同一溫度和反應時間用1：10稀釋的酶進行嘗試。
凝膠電泳
1．將0.8％的瓊脂糖在0.25×TBE中熔化后冷卻至50～60℃，立即注入凝膠框架中，并插入梳子。
2．凝膠固化后小心地拔出齒梳，用2把無菌手術刀將DNA凝膠塊上樣。若用不同內切酶消化凝膠塊，則取不同樣品時應將手術刀片燒灼后冷卻。將DNA大小標志物上樣至凝膠的兩旁。
3．用1％液態低熔點瓊脂糖凝膠（0.25×TBE配制）密封狹槽。
4．若有氣泡存在，用注射器驅趕氣泡。
5．一旦密封的低熔點瓊脂糖已固化（大約10min），可將凝膠擱入腔室，并用電泳緩沖液覆蓋過膠面。
6．應設定合適的電壓及轉換時間（參考《分子醫學技術》84頁表8.1）并開始電泳。兩個不同電泳方向的電流應相等。
7．電泳結束后，凝膠用0.25×TBE配制成的EB（0.4μg/ml）染色。
8．用泵自槽中排除緩沖液，續以雙蒸水沖洗電泳槽。
9．凝膠成像：DNA在曝光的過程中可能會形成缺口。
10． 用0.25mol/L HCl漂洗凝膠30min，讓DNA脫嘌呤，并有利于轉移。
11． 凝膠用堿（變性溶液中）變性20min，兩次，續以中性溶液1～5min。
12． 采用標準Southern印跡方案將DNA轉印至尼龍膜上。一般來說，印跡PFGE凝膠的時間較普通凝膠印跡時間長（約48h）。
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