流感裂解疫苗
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流感病毒裂解疫苗
Liugan Bingdu Liejie Yimiao
Influenza Vaccine （Split Virion）, Inactivated
本品系用世界衛(wèi)生組織（WHO）推薦的并經(jīng)國(guó)家藥品管理部門批準(zhǔn)的流感病毒株分別接種雞胚，經(jīng)培養(yǎng)、收獲病毒液，病毒滅活、純化、裂解后制成。用于預(yù)防本型病毒引起的流行性感冒。
1 基本要求
生產(chǎn)和檢定用設(shè)施、原材料及輔料、水、器具、動(dòng)物等應(yīng)符合 “凡例”有關(guān)要求。
2 制造
2.1生產(chǎn)用雞胚
毒種傳代和制備用雞胚應(yīng)來(lái)源于SPF雞群。疫苗生產(chǎn)用雞胚應(yīng)來(lái)源于封閉式房舍內(nèi)飼養(yǎng)的健康雞群，并選用9~11日齡無(wú)畸形、血管清晰、活動(dòng)的雞胚。
2.2 毒種
2.2.1 名稱和來(lái)源
生產(chǎn)用毒種為WHO推薦的甲型和乙型流行性感冒病毒株，經(jīng)檢定證明為WHO當(dāng)年推薦的病毒株或相似株。
2.2.2種子批的建立
應(yīng)符合 “生物制品生產(chǎn)檢定用菌毒種管理規(guī)程”規(guī)定。以WHO推薦并提供的流感毒株代次為基礎(chǔ)，傳代建立主種子批和工作種子批，至成品疫苗病毒總傳代不得超過(guò)5代。
2.2.3種子批檢定
主種子批應(yīng)做以下全面檢定，工作種子批應(yīng)至少進(jìn)行2.2.3.1-2.2.3.5項(xiàng)檢定。
2.2.3.1 鑒別試驗(yàn)
血凝素型別鑒定：應(yīng)用相應(yīng)（亞）型流感病毒特異性免疫血清進(jìn)行血凝抑制試驗(yàn)，結(jié)果應(yīng)證明其抗原性與推薦的病毒株相一致。
2.2.3.2 病毒滴度
應(yīng)用雞胚半數(shù)感染劑量法（EID50）檢查，病毒滴度應(yīng)不低于6.5LgEID50/ml。
2.2.3.3 血凝滴度
采用血凝法檢測(cè)，血凝滴度應(yīng)不低于1：160。
2.2.3.4無(wú)菌檢查
依法檢查（附錄XII A），應(yīng)符合規(guī)定。
2.2.3.5支原體檢查
依法檢查（附錄XII B），應(yīng)符合規(guī)定。
2.2.3.6 外源性禽白血病病毒檢測(cè)
用相應(yīng)（亞）型的流感病毒特異性性免疫血清中和病毒后，接種SPF雞胚細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)，用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)培養(yǎng)物，結(jié)果應(yīng)為陰性。
2.2.3.7 外源性禽腺病毒檢測(cè)
用相應(yīng)（亞）型的流感病毒特異性性免疫血清中和病毒后，接種SPF雞胚肝細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)，分別用適宜的血清學(xué)方法檢測(cè)其培養(yǎng)物中的I型和III型禽腺病毒，結(jié)果均應(yīng)陰性。
2.2.4 毒種保存
凍干毒種應(yīng)于－20℃以下保存，液體毒種應(yīng)于－60℃以下保存。
2.3 單價(jià)病毒原液
2.3.1 病毒接種和培養(yǎng)
于雞胚尿囊腔接種經(jīng)適當(dāng)稀釋的工作種子批毒種， 置33～35oC培養(yǎng)48~72小時(shí)。一次未使用完的工作種子批毒種，不得再回凍繼續(xù)使用。
2.3.2 病毒收獲
篩選活雞胚， 置2~8oC一定時(shí)間冷胚后，收獲尿囊液于容器內(nèi)。逐容器取樣進(jìn)行尿囊收獲液檢定。
2.3.3 尿囊收獲液檢定
2.3.3.1 微生物限度檢查
菌數(shù)應(yīng)小于105CFU/ml，沙門氏菌檢測(cè)應(yīng)為陰性（附錄XII G）。
2.3.3.2 血凝滴度
按2.2.3.3項(xiàng)進(jìn)行， 應(yīng)不低于1：160。
2.3.4 尿囊收獲液合并
每個(gè)收獲容器的含單型流感病毒的尿囊液檢定合格后可合并為單價(jià)病毒合并液。
2.3.5 病毒滅活
在規(guī)定的蛋白質(zhì)含量范圍內(nèi)進(jìn)行病毒滅活。單價(jià)病毒合并液中加入終濃度不高于0.2mg/ml的甲醛，置適宜的溫度下進(jìn)行病毒滅活，滅活到期后， 每個(gè)病毒滅活容器應(yīng)立即取樣，分別進(jìn)行病毒滅活驗(yàn)證試驗(yàn)，并進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素含量測(cè)定。（也可在純化后或純化過(guò)程中加入適宜濃度的甲醛溶液進(jìn)行病毒滅活）。
2.3.6 濃縮及純化
2.3.6.1超濾濃縮
采用離心或其他適宜的方法，將單價(jià)病毒合并液進(jìn)行澄清后，采用超濾法將病毒液濃縮至適宜蛋白質(zhì)含量范圍。濃縮后的病毒液應(yīng)取樣進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素含量測(cè)定。
2.3.6.2 純化
超濾濃縮后的單價(jià)病毒合并液可采用柱色譜法或蔗糖密度區(qū)帶離心法進(jìn)行純化，采用蔗糖密度區(qū)帶離心法法進(jìn)行純化的應(yīng)用超濾法去除蔗糖。純化后取樣進(jìn)行蛋白質(zhì)含量測(cè)定。
2.3.7病毒裂解
應(yīng)在規(guī)定的蛋白質(zhì)含量范圍內(nèi)進(jìn)行病毒裂解。將純化后的單價(jià)病毒合并液中加入適宜濃度的裂解劑，在適宜條件下進(jìn)行病毒裂解。
2.3.8裂解后純化
采用柱色譜法或蔗糖密度梯度離心法以及其他適宜的方法進(jìn)行病毒裂解后的再純化，采用蔗糖密度區(qū)帶離心法進(jìn)行純化的應(yīng)用超濾法去除蔗糖。超濾后的病毒液取樣進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素含量測(cè)定和微生物限度檢查， 微生物限度檢查菌數(shù)應(yīng)小于10CFU/ml。
2.3.9 除菌過(guò)濾
純化后的病毒裂解液經(jīng)除菌過(guò)濾后，并加入適宜濃度的硫柳汞作為防腐劑， 即為單價(jià)病毒原液。
2.3.10 單價(jià)病毒原液檢定
按3.1項(xiàng)進(jìn)行。
2.3.11保存
于2～8℃保存。
2.4 半成品
2.4.1 配制
根據(jù)各單價(jià)病毒原液的血凝素含量，將各型流感病毒按同一血凝素含量進(jìn)行半成品配制，（血凝素配制量可在30-36ug/ml范圍內(nèi)， 每年各型別流感病毒株應(yīng)按同一血凝素含量進(jìn)行配制），可補(bǔ)加適宜濃度的硫柳汞作為防腐劑， 即為半成品。
2.4.2半成品檢定
按3.2項(xiàng)進(jìn)行。
2.5 成品
2.5.1分批
應(yīng)符合 “生物制品分批規(guī)程”規(guī)定。
2.5.2分裝
應(yīng)符合 “生物制品分裝和凍干規(guī)程”規(guī)定。
2.5.3 規(guī)格
本品為每瓶（支）0.25ml或0.5ml。每1次人用劑量為0.25ml（6個(gè)月至3歲兒童用），含各流感病毒株血凝素應(yīng)為7.5μg ； 或0.5ml（成人及3歲以上兒童），含各型流感病毒株血凝素應(yīng)為15μg。
2.5.4 包裝
應(yīng)符合 “生物制品包裝規(guī)程”規(guī)定。
3 檢定
3.1 單價(jià)病毒原液的檢定
3.1.1鑒別試驗(yàn)
用相應(yīng)（亞）型特異性免疫血清進(jìn)行血凝抑制試驗(yàn)或單向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)（方法見(jiàn)3.1.3項(xiàng)）， 結(jié)果應(yīng)證明抗原性與推薦流感病毒株相一致。
3.1.2病毒滅活驗(yàn)證試驗(yàn)
將病毒滅活后的供試品10倍系列稀釋， 取原倍、10-1及10-2倍稀釋的病毒液分組接種雞胚尿囊腔，每組接種10個(gè)~11日齡雞胚，每胚接種0.2ml，置33-35oC培養(yǎng)72小時(shí)。24小時(shí)內(nèi)死亡的不計(jì)數(shù)， 每組雞胚須至少存活80%。自存活的雞胚中每胚取0.5ml尿囊液， 按組混合后， 再盲傳一代，每組各接種10個(gè)胚，每胚接種0.2ml，經(jīng)33-35oC培育72小時(shí)后，取尿囊液進(jìn)行血凝試驗(yàn)，結(jié)果應(yīng)不出現(xiàn)血凝反應(yīng)。
3.1.3血凝素含量
采用單向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)檢測(cè)血凝素含量。
將抗原參考品和供試品分別加入到含有抗體參考品抗體的1.5%瓊脂糖凝膠板上， 孔徑為3mm，每孔10μl， 于20-25℃放置至少18個(gè)小時(shí)。用PBS浸泡1小時(shí)后， 干燥、染色、脫色。準(zhǔn)確測(cè)量抗原參考品和供試品形成的沉淀環(huán)的直徑， 以抗原參考品形成的沉淀環(huán)的直徑對(duì)其相應(yīng)抗原濃度進(jìn)行直線回歸， 求出直線回歸方程， 代入供試品的沉淀環(huán)直徑， 即可得到供試品的血凝素含量， 應(yīng)不低于90μg/（株﹒ml）。
3.1.4無(wú)菌檢查
依法檢查（附錄XII A），應(yīng)符合規(guī)定。
3.1.5 蛋白質(zhì)含量
蛋白質(zhì)含量應(yīng)不高于血凝素含量的4.5倍（附錄VI B 第二法）。
3.2 半成品檢定
3.2.1血凝素含量
按3.1.3項(xiàng)進(jìn)行，各型別流感病毒株血凝素含量應(yīng)為配制量的80％－120％。
3.2.2 裂解劑殘留量
采用聚山梨酯80為裂解劑的，其殘留量應(yīng)小于80μg/ml（附錄VI H）； 采用Triton X-100為裂解劑的， 其殘留量應(yīng)小于300μg/ml；采用Triton N101為裂解劑的， 其殘留量應(yīng)小于300μg/ml。
3.2.3無(wú)菌檢查
依法檢查（附錄XII A），應(yīng)符合規(guī)定。
3.3 成品檢定
3.3.1 鑒別試驗(yàn)
用相應(yīng)（亞）型特異性免疫血清進(jìn)行單向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)， 結(jié)果應(yīng)證明抗原性與推薦病毒株相一致。
3.3.2 外觀
應(yīng)為微乳白色液體，無(wú)異物。
3.3.3 裝量
按附錄I A裝量項(xiàng)進(jìn)行， 應(yīng)不低于標(biāo)示量。
3.3.4 pH值
應(yīng)為6.5～8.0（附錄V A）。
3.3.5 游離甲醛含量
應(yīng)不高于50μg/ml（附錄VI L）。
3.3.6 硫柳汞含量
應(yīng)不高于100μg/ml（附錄VII B）。
3.3.7 血凝素含量
按3.1.3項(xiàng)進(jìn)行，各型別流感病毒株血凝素含量應(yīng)為配制量的80%-120%。
3.3.8 總蛋白質(zhì)含量
應(yīng)不高于400μg/ml；并不得超過(guò)疫苗中血凝素總含量的4.5倍（附錄VI B 第二法）。
3.3.9 卵清蛋白含量
采用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)， 卵清蛋白含量應(yīng)不高于500ng /ml。
3.3.10無(wú)菌檢查
依法檢查（附錄 XII A），應(yīng)符合規(guī)定。
3.3.11 異常毒性檢查
依法檢查（附錄 XII F），應(yīng)符合規(guī)定。
3.3.12 細(xì)菌內(nèi)毒素含量
應(yīng)小于20EU/ml（附錄XII E凝膠限量試驗(yàn)）。
3.3.13 抗生素殘留量檢查
病毒培養(yǎng)過(guò)程中加入抗生素的應(yīng)進(jìn)行該項(xiàng)檢查， 采用酶聯(lián)免疫法， 應(yīng)不高于10ng/ml。
4 保存、運(yùn)輸和效期
于2-8oC避光保存和運(yùn)輸。自生產(chǎn)之日起，有效期為12個(gè)月。
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