寄生蟲學/寄生蟲標本的保存

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寄生蟲標本的保存，除制成玻片標本永久保存外，還可用以下各種保存方法。

一、原蟲包囊和蟲卵的保存

汞碘醛液10ml與糞便1g混勻后密封在瓶內，可保存其中的原蟲包囊及蟲卵數月之久，也可在經濃集法處理的糞便沉渣中加等量或1倍量的10%甲醛液（加熱至70℃），搖勻，用石蠟封固瓶口。

二、蠕蟲成蟲的保存

1.線蟲　生理鹽水洗凈后用加熱至70～80℃的70%酒精或巴氏液（甲醛3份，生理鹽水97份固定，冷卻后移至新的70%酒精或巴氏液中保存。小型線蟲（如旋毛蟲、蟯蟲、鉤蟲等）宜用甘油酒精（70%酒精95ml，甘油5ml）加熱固定，保存于80%酒精中；也可用冰醋酸固定約半小時后移入70%酒精或甘油酒精中保存。

2.吸蟲　小型吸蟲可置于小瓶中，加生理鹽水，用力搖蕩數分鐘，倒去生理鹽水，注入固定液。較大的吸蟲應先放在薄荷腦酒精液（薄荷腦24g，95%酒精10ml）中，使蟲體肌肉松弛，用載玻片壓平后固定，或將洗凈后的吸蟲放在兩片載玻片間用細線緊扎壓平后固定。

固定一般用10%甲醛，24小時后移至5%甲醛中保存；或用70%酒精固定0.5～3小時，視蟲體大小而定，再移至新的70%酒精中保存。

3.絳蟲　大型絳蟲（如豬、牛帶絳蟲）經清水洗滌數次后，在生理鹽水（4℃）中經過數小時或過夜，蟲體可完全伸展，此時以3%福爾馬林固定，24小時后移至5%福爾馬林中保存，必要時也可先用大玻璃板壓平后固定。小型絳蟲洗滌后可在3%福爾馬林中固定3～5小時，用載玻片輕壓，沿蓋玻片邊緣加5%甲醛固定數小時，最后保存在5%福爾馬林溶液中。

三、昆蟲的保存

1.干標本保存系保存有翅昆蟲成蟲。可用特制的昆蟲針針插蟲體。大型昆蟲（蠅、虻等）用1～3號昆蟲針，從蟲體背面、中胸右側直插（圖21-9）。注意保持左側完整，以便鑒定。小型昆蟲（蚊、蛉、蚋、蠓等）可用00號短針自胸部腹面兩中足基部之間插入，不可刺透胸背，再用另一長針從軟木片另一端插下。最后各插一硬紙片，記錄名稱、采集地點與時間，并將之插于昆蟲盒軟木板上或玻璃管的軟木塞上。昆蟲盒內放入紙包的樟腦粉即可。如標本數量多（圖21-9），可保存于塑料管（或玻璃管）中，管底放少量樟腦粉，再鋪上棉花、濾紙各一層，昆蟲標本放于濾紙上，用軟棉紙包棉花，輕塞在昆蟲標本上方，瓶口加軟木塞，再以蠟封之。

有翅昆蟲針插法

圖21－9　有翅昆蟲針插法

2.濕標本保存用于保存有翅昆蟲的卵和幼蟲期及無翅昆蟲和蜱螨類的發(fā)育各期。活標本先經加溫的70%酒精（60～70℃）固定，一天后保存于5%甘油酒精（7%）中；也可用5%或10%福爾馬林和Bless液固定保存。

所有保存標本須詳細記錄標本名稱、宿主、采集地點、采集日期及采集者姓名。

樟腦混合劑配制：樟腦粉6份，氯仿1份，木餾油1份，石蠟油4份。先將樟腦粉1.5份與氯仿1份混合，隨后加樟腦1.5份與木餾油1份，用玻璃棒混勻，最后加樟腦粉3份及石蠟油4份，再攪勻備用。此混合劑易燃，宜置于嚴密而不透氣的瓶內儲藏。

常用固定液配制：

⑴酒精：通常用70%或75%酒精為固定液。用商品供應95%酒精作稀釋配制。取95%酒精加至需要稀釋的濃度，再加蒸餾水到95ml即可；或者，可按下列稀釋公式配制：

所需酒精濃度 ×配成酒精量=所需原酒精量（ml）原酒精濃度

配成酒精量-所需原酒精量=應加蒸餾水量（ml）

⑵福爾馬林（37%～40%的甲醛水溶液）：常用固定液的濃度為5%～10%。如需保持中性，在配制過程中，可在500ml原液（37%～40%的甲醛水溶液）加入約2cm厚碳酸鎂，或放幾小塊大理石（碳酸鈣）中和之；也可采用下列配方配制（10%福爾馬林）：福爾馬林原液100ml，蒸餾水900ml，碳酸二氫鈉（Na₂H₂PO₄.H₂O）4g，碳酸氫二鈉（Na₂H₂PO₄）0.5g混合配成。

⑶布氏（Bless）液：福爾馬林原液7ml，酒精（70%）90ml，冰醋酸（臨用前加入）3～5ml混合配成。

四、原蟲低溫保存

用液氮保存原蟲，具有保持原蟲生物學特性，且保存時間較長的優(yōu)點。現僅介紹瘧原蟲、弓形蟲、人毛滴蟲及陰道毛滴蟲的低溫保存方法。

1.凍存方法

惡性瘧原蟲：將從受染者采得的抗凝含蟲血或體外培養(yǎng)的培養(yǎng)物，經1500rpm離心10分鐘，加入與沉積細胞等量的24%二甲基亞砜（DMSO）生理鹽水溶液（0.9%生理鹽水或5%葡萄糖生理鹽水76ml中加入DMSO24ml）保護劑，充分混勻后在室溫中放置30分鐘，按0.5～1.0ml分裝入無菌安瓿（或塑料管）內，封口（或蓋嚴）后將之放入標明批號的紗布袋中，裝于液氮罐的提筒內，先置于液氮罐的頸部，該處約為-70℃，30分鐘后，置液氮中（-196℃）凍存。

鼠瘧原蟲：從感染瘧原蟲第3～4天的小鼠心臟取血（或摘除眼球取血），注入試管，肝素抗凝，加入等量的10%或15%DMSO及15%或20%小牛血清為保護劑；或加入等體積的甘油、山梨醇保護液（4.2%山梨醇生理鹽水180ml加純甘油70ml），充分混勻。按照上法裝管及凍存。也可以在1mm³陽性鼠血加0.1mm³的3.8%枸櫞酸鈉抗凝之后就裝于液氮罐提筒中，立即直接置液氮中保存，2年內多數原蟲仍有活力。

弓形蟲：用無菌注射器吸取10%DMSO2ml，注入感染4天的小鼠腹腔，抽洗2次，抽出液混勻后即注入無菌塑料管內（0.5～1ml/管），凍存法同上。

陰道毛滴蟲：用無菌拭子取陰道分泌物，放入培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時，轉種于RPMI-1640培基中2天。取含蟲培養(yǎng)液經1000rpm/min離心10分鐘，在沉淀中加入10%DMSO2ml，同上法分裝及凍存。

人毛滴蟲：取腹瀉患者的含蟲糞便培養(yǎng)于洛氏培養(yǎng)基中48小時，轉種于洛氏培養(yǎng)基或RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)2天后計算蟲數（達7×10⁵）。加等量10%DMSO并加Tween-20于DMSO中。裝管同上法。但凍存過程應先將小管置于-10℃中15分鐘，移到液氮罐頸2分鐘，再置入液氮中凍存。

上述所用的保護劑（液）均應經高壓滅菌，保存于4℃冰箱。RPMI-1640配制50%DMSO，用時再稀釋所需濃度，加15%或20%小牛血清，調pH至7.2。

2.復蘇與觀察在凍存1～2年，需要時從液氮罐中取出保種的小管，迅速投入37～40℃溫水中，經4～5分鐘即溶化。取凍存的鼠瘧原蟲和弓形蟲分別經腹腔接種2只小鼠，每只ml，觀察致病情況；也可接種后4～5天分別取鼠血或腹腔液，作涂片，姬氏液染色，鏡檢原蟲。兩種毛滴蟲可用同樣方法復蘇，但需經培養(yǎng)3～4天后，作涂片鏡檢活動滋養(yǎng)體，或染色觀察。