基礎檢驗學/陰道分泌物微生物檢查

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臨床基礎檢驗學

排泄物和分泌物檢查
- 陰道分泌物檢查
  - 陰道分泌物標本的采集
  - 陰道分泌物外觀及清潔度檢查
  - 陰道分泌物微生物檢查

（一）原蟲

引起陰道感染的原蟲主要有是陰道毛滴蟲，可致滴蟲性陰道炎。病人外陰灼熱痛、瘙癢，陰道分泌物呈稀膿性或泡沫狀，將此分泌物采用生理鹽水懸滴法置于低倍顯微鏡下觀察，可見波動狀或螺旋狀運動的蟲體將周圍白細胞或上皮細胞推動。在高倍鏡下可見蟲體為8-45μm，呈項寬尾尖倒置梨形，大小多為白細胞的2-3倍，蟲體項端有前鞭毛4根，后端有后鞭毛一根，體側有漢動膜，借以移動。此時陰道分泌物的清潔度為Ⅲ、Ⅳ度。

陰道貌岸然毛滴蟲生長繁殖的適宜溫度為25-42攝氏度，故在檢驗時應注意保溫，方可觀察到陰道毛滴蟲的活動。陰道分泌物中查到陰道分泌物滴蟲是診斷滴蟲性陰道炎的依據，近年來采用陰道毛滴蟲單抗制的膠乳免疫凝聚法劑盒可提高滴蟲性陰道炎的診斷率。

在陰道分泌物中見到溶組織阿米巴滋養體時，提示為阿米巴性陰道炎。

（二）真菌

陰道真菌有時在陰道中存奪而無害，在陰道抵抗力減低時容易發病，真菌性陰道炎發找到真菌為診斷依據，陰道真菌多為白色假絲酵母菌，偶見陰道纖毛菌、放線菌等。采用懸滴法于低倍鏡下可見到白色絲假酵母菌的卵圓形孢子和假菌絲。如取陰道分泌物涂片并時行革蘭氏染色后油觀察，可見到卵圓形革蘭氏陽性孢子或與出芽細胞相連接的假菌絲，成鏈狀及分支狀。

（三）淋病奈瑟菌

淋病是目前世界上發病率較高的性傳播疾病之一。國內統計約占門診性病患者的40%。人類是淋病奈瑟菌唯一的宿主。在性關系紊亂情況下造成在人群中的廣泛傳染及流行。臨床上多婁箐南現急性癥狀，少數為慢性過程。淋病奈瑟菌的檢查首先采用涂片法，發宮頸管內分泌物涂片的陽性率最高，為100%；陰道上1/3部分為84%；陰道口處為35%。一般需將宮頸表面膿液試去，用棉拭子插入宮頸管1厘米深處停留10-30s，旋轉一周取出，將分泌生淫在玻片上，革蘭氏染色后油鏡檢查，找革蘭氏陰道性雙球菌，形似腎或咖啡豆狀，凹面相對，除散在于白細胞之間外，還可見其被吞噬于中性粒細胞胞質之內，因淋病奈瑟菌對各種理化因子抵抗力弱，涂片法可被漏診，必要時可進行淋病奈瑟菌培養，且有利于菌株分型和藥過敏試驗。近年來采用單克隆抗體技術生產的淋病抗血清，可與受檢查者宮頸分泌物中的淋病奈瑟菌結合，采用免疫熒光技術，在30分鐘內即可準確得出結果。比培養法快，比涂片支準確，較易掌握。此外運用PCR技術也可對淋病奈瑟菌過少，雜菌過多的標本進行診斷。

對于淋病非顯性感染者，其淋病奈瑟菌的鏡檢出和培養檢查常為陰性，但卻是淋病的重要傳染源。為此，近年來制備了多種檢測淋病奈瑟菌的基因探針。大部分淋病奈瑟菌內含有多拷貝的4。2kb隱蔽性質粒，此外淋病奈瑟菌青毒素抗性主要是由編碼β-骨酰胺酶的質粒決定的，用這兩種質粒標記的探針與陰道分泌物進行斑點雜交可分別探測淋病奈瑟菌及其抗藥性。其特異性敏感性均很高。目前還制備出淋病奈瑟菌DNA探針、菌毛探針和RNA探針，也建立了各種特異性高，敏感性強、簡便快速的右面放射性標記的檢測系統，成為淋病奈瑟菌及其抗藥性檢查的重要方法。

（四）陰道加德鈉菌

陰道加德鈉菌（Gardherellavaginalis;GV）和某些厭氧菌共同引起的細菌性陰道病亦屬于性傳播疾病之一。該菌還能以非性行為方式傳播。除引起陰道病外，尚可引起早產、產褥熱、新生兒敗血癥、絨毛膜羊膜炎、不后敗血癥和膿毒血癥等。陰道加德鈉菌產生高濃度的丙酮酸的氨基酸，可被陰道厭氧菌群脫羧基生成相應的胺，引起皮膚粘膜過敏。血管通透性增加，上皮細胞脫落，陰道分泌物呈奶油狀大量排出，有惡臭。患者陰道分泌物革蘭氏染色后可見陰道性或染色不定有時可染成革蘭氏陽性的小桿菌。大小為（1.5-2.5）μm×0.5μm,具有多形性，呈桿狀或球桿狀，陰道分泌物PH常大小4.5，胺試驗陽性。

除對陰道加德鈉菌形態學鑒別外，還可進行陰道菌群檢查，由于細菌性陰道貌岸然病時乳酸桿菌減少，加德鈉氏菌的厭氧菌增加，可計算乳酸桿菌和加德鈉菌的數量變化，作為本病診斷參考。一般取陰道分泌物涂片，革蘭氏染色，用油鏡觀察3-5個視野，計算各種菌的數量。乳酸性桿菌為革蘭氏陽性大桿菌，（1-5）μm×1μm，常成雙，單根、鏈狀或柵狀排列，非細菌性陰道病乳酸桿菌>5個/油視野僅見少許加德鈉菌。細菌性陰道病不僅可見到加德鈉菌，還有其它革蘭氏陰性或陽性桿菌，無乳酸桿菌或小于5個/油鏡視野。

尋找陰道分泌物中的線索細胞，是診斷加德鈉菌性陰道貌岸然病的重要指標。線索細胞為陰道鱗狀上皮細胞粘附多數加德鈉菌所致生理鹽水涂片可見該細胞邊緣呈現鋸齒狀。細胞已有溶解，核模糊不清，其上附著大量加德鈉菌及厭氧菌，使其表面毛糙，有斑點和大量的細小顆粒，亦右用吖啶橙染色法或相差顯微鏡觀察法檢查線索細胞。此外還可用培養、熒光板、氣-液色譜分析和PCR方法等助診。

（五）衣原體

泌尿生殖道沙眼衣原體感染是目前很常見的性傳播疾病之一，國外報道生殖道感染率為10。8%，由于感染后無特異癥狀，易造成該病流行，引起子性急性陰道炎和宮頸炎。及原體感染的白帶膿性粘液，與細菌感染的膿性白帶不同。取膿性分泌物涂片，吉姆薩染色，有進時可見到細胞內包涵體，但陽性率很低。過去采用傳統的組織培養分離衣原體的方法，技術難度大，特異性敏感性均不理想，且費時費錢。目前應用較多的是熒光標記的單克隆抗體的直接熒光抗體法，可快速確定系何種血清型衣原體敏感。80年代發民展的DNA探針技術，可將陰道分泌物經PBS稀解，離心后沉淀物經蛋白求恩酶K水解，酚/氯仿抽提等處理后與沙眼衣原體探針，如外膜蛋白基因的高度保守序列，或TE-55DNA探針等進行斑點雜交，可檢出沙眼衣原體的15個血清型，而與其它細菌，病毒、立克次體等無交叉反應，敏感性和特異性均為95%左右。DNA探針方法對泌尿生殖道衣原體疾病的診斷、流行病學調查和無癥狀衣原體攜帶者的診斷很有意義。

（六）病毒

在人類性傳播疾病中有相當一部分是由病毒引起的。可從陰道分泌物中檢測的病毒有：

1．單純皰疹病毒（herpes simplex virus,HSV）有二個血清型，HSV-I和HSV-Ⅱ型。引起的生殖道感染的以Ⅱ型為主，約占85%。表南為生殖器官皰疹，潰瘍并通過胎盤引起胎兒感染，發生死胎、流主和畸形。實驗診斷多取病損處分泌物涂片進生細胞學檢測、病毒培養或熒光抗體檢測。在孕期感染的監測中，可采取宮頸部位分泌物做包涵體檢查。單純皰疹病毒以侵犯軍團頸鱗狀上皮多見。感染早期細胞輕度或中度增大，核呈嗜堿性不透明的勻質狀毛玻璃樣外觀，偶伴有核空泡化。由于核的增殖與胞質腫大而形成多核或巨大細胞。感染晚期可發現細胞核內有嗜伊紅包涵體，周圍有透明暈，由于陰道分泌物檢查陽性率低，病毒培養操作復雜費時，近年來對HSV的檢查主要采用熒光抗體檢查或分子生物方法診斷，特別是利用HSV基因組中特異性強的DNA片段棗HSV-I和HSV-Ⅱ，胸腺激酶的寡核苷酸探針和RNA探針進行分子雜交，可快速而靈敏地對HSV感染作出診斷。

2．人巨細胞病毒（human cytmegalovirus,HCMV）是先天感染的主要病原。一次感染后終年潛伏于體內，在機體免疫力低下時病毒激活，可表現為巨細胞包涵體病。孕期胎兒中樞神經系統受到侵犯可致小頭畸形、智力低下、視聽障礙等后遺癥。故孕婦陰道分泌物巨細胞病毒檢查對孕期監測尤其是重要的，常用宮頸拭子采取分泌物送檢。HCMV實驗室診斷方法除傳播病毒離法外，光鏡檢測包涵體陽性就緒極低，電鏡可直直接見到典型的皰疹病毒類形態結構，但無特異性，目前可采用CC-ABC法，即將標本接種于人胚肺成纖維細胞培養細胞，使病毒在敏感細胞中增殖，培養2天后收獲，再用針對HCMV早期抗原的單克隆抗體，利用生物素親和素放大作用染色鑒定。亦可用HCMV、DNA片段或RNA探針與樣品進行斑點雜交，夾心雜交或 PCR后勤部的分子雜交來檢測，臨床最常用的方法是用ELISA法檢測孕婦血清 HCMV-IGM來診斷活動性感染。

3．人乳頭狀病毒（human papillomavirus,HPV）HPV目前鑒別有50余型。引起婦性生殖道感染的有23型，其中最主要的有6，11，16，18，31，33，型。HPV感染細胞后細胞的作用的主要表現為：①增殖感染，即病毒在宿主細胞內復制，產生感染子代致使細胞死亡。②細胞轉化，引起腫瘤發生，主要是引起生殖道鱗狀上皮肉瘤樣變，如16，18，31，33，35，29，型，尤其是宮頸癌患者以檢查出16，18型為多見。HPV檢測亦可采用傳統的病毒培養、分泌物涂片、光鏡檢測。HE染色可見核周空暈。“氣球樣”病毒感染空泡細胞，但陽性率很低。下生殖道疣狀贅生物者常可進行病理學鏡可電鏡檢查，可崢到典型的病毒感染細胞或閏毒顆粒。目前常采用ABC法以兔抗HPV為一抗，生物素標記的羊抗兔IGG為二抗檢測病毒抗原。或采用病毒相應的寡核苷酸探針，與陰道分泌物中提取的DNA進行斑點雜交或夾心雜交進行檢測。如采用PCR技術則可檢測極微量的HPV（即10⁶個細胞中有一個感染細胞）