基礎(chǔ)檢驗(yàn)學(xué)/胎兒成熟度檢查
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先天性疾病包括遺傳性疾病，即親代的病態(tài)基因經(jīng)生殖細(xì)胞配子結(jié)合形成合子時(shí)傳給子代的疾病，和非遺傳因素，如一些在配子形成，染色體聯(lián)會(huì)時(shí)的基因突變，受精卵以育等過程中由于某些外在因素的影響而引起和疾病。這類疾病表現(xiàn)為患兒智力，器官結(jié)構(gòu)和功能和種種缺陷。
產(chǎn)前診斷中可將先天性遺傳性關(guān)病分為三大類：
1．染色體病：由于遺傳或環(huán)境因素引起染色體的數(shù)目及結(jié)構(gòu)上的異常造成的疾病。在臨床上可發(fā)現(xiàn)新生兒的有多種畸形并常伴有智力障礙。這類病紅占出生總數(shù)的0.5%，產(chǎn)前診斷的25-50%。
2．單基因遺傳病：僅有一對(duì)基因發(fā)生突變或異常引起的疾病。絕大多數(shù)表現(xiàn)為酶的缺陷。臨床上稱為先天性代謝病。目前能用生化方法診斷的約有300種，其中50%為常染色體顯性遺傳，40%為常染色體隱性遺傳，10%為性連鎖遺傳全以X伴性遺傳為多見。一般占出生總數(shù)的1.8%，產(chǎn)前診斷的6-10%。
3．多基因遺傳病：兩對(duì)以上的多對(duì)基因突變。各對(duì)基因呈共顯性，每對(duì)基因的作用是微小的，但若干對(duì)基因作用積累，或形成一個(gè)明顯的效應(yīng)，在臨床上出現(xiàn)一個(gè)病狀群，主要表現(xiàn)為一些先天畸形，如唇、腭裂和畸形足、脊柱裂、無腦兒、神經(jīng)管畸形、幽門狹窄、先天性髖關(guān)節(jié)脫位、先天性心臟病等，這類病占出生總數(shù)的2.6%，產(chǎn)前診斷的40-50%。某些多基因異常遺傳病，如I型糖尿病、高血壓病、冠心病、哮喘、精神分裂癥等常是遺傳因素與環(huán)境因素共同作用的結(jié)果，它只能從群體調(diào)查和空族系譜的發(fā)病率中了解其分布及復(fù)現(xiàn)率。
一、染色體病核型分析
核型分析主要用于檢查染色體因婁衢虞結(jié)構(gòu)異常而造成的遺傳性疾病。一般是將新鮮的羊水20-30毫升，經(jīng)離心得到羊水中的細(xì)胞，經(jīng)RPMI1640培養(yǎng)液與25%小牛血清中培養(yǎng)8-10天后，以秋水仙素處理，使細(xì)胞均停止在M期，經(jīng)獲得分裂相細(xì)胞，將細(xì)胞經(jīng)低參、固定、制片處理后，進(jìn)行Giemsa染色或用顯帶染色，然后進(jìn)行核型分析。
（一）性染色質(zhì)檢查
羊水細(xì)胞性染色質(zhì)的檢查有助于診斷性連鎖性遺傳病(sex linked inheritance disease,)如甲、乙型血友病，原發(fā)性低丙種球蛋白血癥，自毀容貌綜合征，肌營養(yǎng)不良，G-6PD缺乏癥。粘多糖沉積病二型，糖原代謝病二型如果父親為X-連鎖隱性基因攜帶者，攜帶者，父親正常，則男胎一半正常，一半工半為患者；女胎一半正常，一半為基因攜帶者，可根據(jù)檢測結(jié)果決定是否繼續(xù)妊娠。常規(guī)的檢查方法是將羊呂10毫升注入離心管，以1000r/min1離心0min棄上清，管底沉淀物加甲醇冰乙酸液8ml固定30min，按前述條件離心棄上清，再加少許新鮮固定液制備成細(xì)胞懸液，取1-2滴于載玻片上，空氣中干燥待染色。
羊水細(xì)胞制片選用于：①X染色質(zhì)檢查（examination of X chromatin 或Barr rest）：一般采用硫瑾或甲苯胺藍(lán)染色，經(jīng)油鏡觀察。鏡下可見到兩類細(xì)胞核，一類核大，核膜完整，結(jié)構(gòu)清晰，染色質(zhì)均勻，稱可數(shù)細(xì)胞；加一類核小固縮或染色過深，結(jié)構(gòu)分辨不清或核重疊，有破損，為非或細(xì)胞。在可數(shù)細(xì)胞的核膜內(nèi)緣處，見到呈深藍(lán)色的三角形，半圓形或饅頭形的染色質(zhì)塊，其大小約1.2μm×0.7μm 左右，即X染色質(zhì)，記錄X性染色質(zhì)的細(xì)胞當(dāng)選目算出其百分率。X染色質(zhì)≥6%者判為女胎，≤5%者判為男胎。②Y染色質(zhì)的檢查采用阿的平熒光染色，在熒光顯微鏡下觀察，可崢細(xì)胞核的偏中心部或近核膜處有 0.3μm大小的熒光弧狀圓點(diǎn)，輪廓清晰，較其周圍的核質(zhì)熒光屏光為強(qiáng)，有時(shí)熒光點(diǎn)過大或過小，所發(fā)熒光很強(qiáng)，與其余核質(zhì)所熒光分開，這種熒光小體就是Y染色質(zhì)。當(dāng)熒光點(diǎn)過大或過小，所發(fā)熒光很弱與核質(zhì)熒光無區(qū)別時(shí)，則不是Y染色質(zhì)。選擇核均勻，核完整清晰的可數(shù)細(xì)胞，計(jì)算出有Y染色質(zhì)細(xì)胞的百分率，Y染色質(zhì)細(xì)胞≥5%診斷為男胎，<4%婦胎。如羊水細(xì)胞中X、Y小體同時(shí)大于等于5-6%應(yīng)考慮是否為性染色體數(shù)量異常，此種病例應(yīng)直一步分析核型。
（二）、性別基因診斷
目前隨著基因的診斷技術(shù)發(fā)展，胎兒性別診斷有了更準(zhǔn)確、更靈敏的方法，使對(duì)于性連鎖疾病診斷的正確性可靠性大為提高。最常用的方法是：
1．Y特異DNA探針對(duì)人性別診斷，有關(guān)Y染色體DNA的探針有多種，如PHY3.4，PHY2.1等，目前最公認(rèn)的是Y染色體特異的SRY基因，在男性性別決定中起關(guān)鍵作用。將羊水細(xì)胞用細(xì)胞裂解液解后，點(diǎn)于硝酸纖維膜上與32P標(biāo)記SRY基因探針直接進(jìn)行斑點(diǎn)雜交，或?qū)⒀蛩?xì)胞DNA經(jīng)0.7%瓊脂糖凝膠電泳分離后進(jìn)行Southern印跡雜交，凡出現(xiàn)雜交斑點(diǎn)或代的為男性，不顯示或顯示極弱者為女性。
2.PCR基因擴(kuò)增法測定性別以常規(guī)蛋白酶-SDS-酚法提取羊水細(xì)胞DNA0.1-1.0μg或直接羊水細(xì)胞裂解得到DNA為模板，進(jìn)行PCR基因擴(kuò)增測定胎兒性別，用于產(chǎn)前診斷胎兒性別的Y染色體基因有4種：DYZ1，DYS14，ZFY和SRY。目前認(rèn)為SRY是睪刃決定因子的最佳候選基因，以兩對(duì)SRY基軒HMGRox保守序列的引物進(jìn)行DNA擴(kuò)增1.5%瓊脂糖電泳，溴化已錠染色，根據(jù)фXHae分子量標(biāo)準(zhǔn)，男性胎兒在分子量為271bp處可見一SRY特異區(qū)帶。
三、生化及免疫學(xué)檢查
羊水是清液的生化及免疫學(xué)檢查主要用于遺傳性代謝的病的檢測。目前已知的遺傳性代謝病有3000多種，有89種可進(jìn)行產(chǎn)前診斷。這些先天性代謝病產(chǎn)前診斷方法大都比較復(fù)雜。目前臨床實(shí)驗(yàn)室能夠開展一些簡單方法主要用于粘多糖沉各種積病，開放性神經(jīng)管缺陷和某些酶缺陷的檢查。
（一）粘多糖沉積病的檢查
粘多糖沉積病是由于細(xì)胞溶酶體酸性水解酶先天性缺陷所致。根據(jù)病因目前本病可分為八大類型，我國已報(bào)告200從余例，主要表現(xiàn)為嚴(yán)重的骨骼畸型、腫脾腫大，智力障礙以及其它畸形。粘多糖沉積病產(chǎn)前診斷以測定培養(yǎng)羊水細(xì)胞內(nèi)特異的酶活力最為可靠，但實(shí)驗(yàn)要求高，一般實(shí)驗(yàn)室難開展。兩種較簡單的實(shí)用的方法是甲苯胺藍(lán)定性及糖醛酸法半定量測定。
1．甲苯胺藍(lán)定性：方法同尿液粘多糖檢查。妊娠早期羊水正常者可呈陽性，妊娠中后期為陰性如陽性提示胎兒患粘多糖沉積病。
2．糖醛酸半定量測定：羊水中酸性粘多糖與四硼酸鈉硫酸溶液反應(yīng)生成糖醛酸，以每毫無肌酐中糖醛酸的量反映酸性糖多糖的多少。隨著妊娠的進(jìn)展，糖醛酸含量逐漸減少，妊娠16-20周的參考值為3.3-7.0mg/mgCr，如高于此值應(yīng)考慮有粘多糖沉積肥病。本法除Morguio綜合征外對(duì)其它類型的粘多糖沉積病均有診斷意義。
（二）神經(jīng)管缺陷的檢查
1．甲胎蛋白測定神經(jīng)管缺陷在產(chǎn)前診斷中占有很大的比例。而羊水甲胎蛋白的測定目前診斷神經(jīng)管缺陷的常規(guī)方法。AFP主要在胎兒肝臟及卵黃囊內(nèi)合成，羊中AFP來自胎兒尿，小部分來自胎兒胃腸道信羊膜，絨毛膜細(xì)胞。正常妊娠羊水中AFP在妊娠15周時(shí)最高，可達(dá)40mg/L，20-22周逐步下降，23周后穩(wěn)定下降，32周后降至25mg/L并一直維持此水平至足月。開放性神經(jīng)管缺陷的胎兒，如無腦兒和脊柱裂，胎血內(nèi)的AFP可從暴露的神經(jīng)組織和脈絡(luò)叢滲入羊水，使AFP高于正常10倍以上。羊水中AFP測定對(duì)胎兒神經(jīng)管缺陷診斷屬非特異性的檢查。胎兒血中AFP含量比羊水高150-200倍，故穿刺傷及胎兒及胎盤，可出現(xiàn)假性升高此點(diǎn)必須注意。AFP測定需將妊娠中期羊水上清稀釋100倍后，按血清AFP免疫學(xué)方法測定。
AFP除用羊水檢測外亦可用母體血篩查，診斷開放糖果經(jīng)管畸形的準(zhǔn)確率達(dá)90%以上，因此具有特殊診斷價(jià)值。此外胎兒其它畸形如先天性腎疾病、食道閉鎖、腦積水、骶尾畸形瘤、染色體異常，糖尿病，先兆子癇等各種原因引起的胎盤功能不足，流產(chǎn)，胎死宮內(nèi)等，羊水AFP也可升高。
2．羊水總膽堿酯酶測定：常用于確認(rèn)升高的羊水AFP水平。羊水含有的膽堿酸酶依其對(duì)乙酰膽堿的親和力差異，分為真性膽堿酯酶和假性膽堿酯酶兩種。胎兒早期機(jī)體內(nèi)即已合成CHE，于妊娠12周時(shí)可測得羊不中CHE顯著升高，當(dāng)胎兒神經(jīng)稍不成熟時(shí)，從胎兒的禽脊液和血液滲出到羊水中的CHE比成熟時(shí)為多，故做為羊水TCHE測定，可用于對(duì)開入性神經(jīng)管缺陷的診斷。測定方法為用丙酰硫代膽堿或乙酰硫代堿用為底物，5，5-二硫代雙為顯色劑的速率法或終點(diǎn)法。
3．羊水中真性乙酰膽堿酯酶測定羊水中真性乙酰膽堿脂酯活性能增加與胎兒開入性神經(jīng)管畸形高度相關(guān)，ACHE定性的聚丙烯酰胺凝臁電泳分析是當(dāng)前常用的方法，特別是對(duì)于神經(jīng)管畸形可疑癥的確診。該方法首先經(jīng)PH8.1電泳將PCHE和ACHE分開，再根據(jù)酶學(xué)反應(yīng)原理，與CHE底物乙酰硫低膽堿和反映示劑共同溫育，CHE分解底物產(chǎn)生的硫代堿膽與銅離子反應(yīng)形成復(fù)合物，在酶區(qū)事業(yè)出現(xiàn)白色沉淀線。正常羊水電泳后可見一條慢速的PCHE區(qū)帶，快速的ACHE區(qū)帶極微。開入神經(jīng)管缺陷羊水可見明顯的快泳的ACHE區(qū)帶，而同時(shí)平等加入ACHE特異抑制劑BW284C51的樣品電泳后，可見此ACHE區(qū)帶消失。ACHE定性電泳時(shí)一定要做陽性與陰性對(duì)照，以保證結(jié)合判斷準(zhǔn)確無誤，漲膠電泳分析為無腦畸形和開入性脊柱裂的篩診陽性率可達(dá)到99.5%，但胎兒患臍疝流產(chǎn)和其它嚴(yán)重先天畸形進(jìn)羊水ACHE也可陽性。因此對(duì)于診斷結(jié)論，決定是否完成或終止妊娠必須結(jié)合其它檢查綜合考慮。
1．γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶測定：正常妊娠羊水GGT活性以妊娠14-15周時(shí)最為高，約為母體血漿的10-100倍，然后漸降，至胎齡30-40周時(shí)，只有15周時(shí)的1/40。于15周左右測定GGT的產(chǎn)前的早期診斷胰腺纖維囊性變的最佳指標(biāo)，預(yù)測準(zhǔn)確性達(dá)77-84%，GGT下降的原因是富含GGT的小腸微絨毛停止發(fā)育或有酶的抑制物釋入羊水所至。此外胎兒的染色的體病，如21三體或18三體綜合征畸胎GGT也明顯的下降。
2．堿性磷酯酶測定羊水ALP在妊娠19周左右活性最高，然后漸降，至29周后活性降至產(chǎn)前水平。在妊娠16-24周羊水ALP中3/4為小腸型，1/4為肝、骨、腎型。胎兒胰腺纖維囊性變時(shí)由于腸粘膜表面微絨毛異常而致小腸型ALP極度下降，此外可協(xié)助診斷此外21三體18三體綜合征畸胎也可見ALP活性降低。
（四）死胎的檢查
1．肌酯激酶測定羊水CK活性與胎齡無關(guān)，在正常孕婦羊水中約為其血清濃度的1/5或更低，主工為CK-BB。羊水中CK升高主要來源于死胎組織的骨骼肌分解，所以CK活性與死亡時(shí)間呈正相關(guān)，而且是CK-MM升高。此外畸胎瘤、腹裂或無腦畸胎羊水的CK-BB含量亦可升高。
2．乳酸脫氫酶測定死胎羊水LD活性明顯升高，但由于宮內(nèi)組織損傷，羊水受紅細(xì)胞污染等均可引起羊水LD增高，故特異性不強(qiáng)。
四、羊水細(xì)胞內(nèi)酶分析
采用微時(shí)測定法測定羊水細(xì)胞中某種酶的活性，診斷胎兒是否有此種酶的異常。方法是將羊水細(xì)胞放在鋪有聚酯膜的塑料培養(yǎng)皿中培養(yǎng)8-14天，待細(xì)胞生長到1000-10000個(gè)時(shí)，迅速將長有細(xì)胞的培養(yǎng)皿冰凍干燥，然后在顯微鏡下將其切成含10-20個(gè)細(xì)胞的小片，在石蠟的保護(hù)下，將其與少量底物保溫，當(dāng)細(xì)胞和底物發(fā)生反應(yīng)后，用毛細(xì)管吸出已形成的熒光顯色產(chǎn)物，在顯微分光光度計(jì)或顯微熒光光度計(jì)下進(jìn)行測定。酶缺陷純合子者不顯色。雜合子者顯色較正常對(duì)照減低。
五、基因工程用于產(chǎn)前診斷
1．DNA分子雜交法，用已知的一段互補(bǔ)DNA作為探針，經(jīng)放射標(biāo)記后與羊水細(xì)胞的DNA進(jìn)行印跡雜交，并用放射自顯影法得出結(jié)果，來診斷胎兒的遺傳性疾病，如用珠蛋白α基因片段兩個(gè)探針檢測α珠蛋白生成障礙性貧血。
2．限制性內(nèi)切酶多態(tài)性位點(diǎn)的連鎖分析DNA限制性內(nèi)切酶能識(shí)別特定的堿基順序，因而能在只別位點(diǎn)特異地把NDA切割成各種一定大小的片段，通過瓊脂糖凝膠電泳的分離，直接用溴化乙錠顯色或用Southern印跡法把這些NDA片段轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，再與已用核素標(biāo)記的特異基因探針進(jìn)行NDA分子雜交，采用放射自顯影技術(shù)，顯示出相應(yīng)的NDA片段，從而可鑒定出是否有基因缺失或異常，例如中國人β珠蛋白生成障礙性貧血的RELP連鎖分析。
3．利用PCR技術(shù)擴(kuò)增NDA探測致病基因利用PCR技術(shù)可將一個(gè)基因拷貝放大10萬倍，所得大量均一的NDA再用寡核苷酸探針雜交，放射自顯影和酶切位點(diǎn)分析探測致病基因。至今利用PCR可推測的遺傳病約有50多種。
以上這些分子生物學(xué)技術(shù)已廣泛用于遺傳性疾病的產(chǎn)前診斷如鐮狀細(xì)胞性貧血，Bart水腫胎兒、HBH病信其它α珠蛋白生成障礙性貧血基因攜帶者、β珠蛋白生成障礙性貧血、甲型血友病、α-抗胰蛋白酶缺乏癥苯丙酮尿癥、杜氏進(jìn)行性肌營養(yǎng)不良、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、Wilson病、Huntington舞蹈病等，做為先天性遺傳性疾病的診斷技術(shù)必將有廣泛的應(yīng)用前景。
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